TNF-α基因沉默抑制磨损颗粒诱导骨溶解的研究

摘要

目的：(1)建立研究磨损颗粒诱导假体周围骨溶解的理想动物模型。(2)探讨应用RNA干扰技术在体外和体内同时抑制TNF-α表达的可行性。(3)探讨在改良小鼠植骨气囊模型内局部应用慢病毒载体系统介导的靶向TNF-α小干扰RNA(siRNA)抑制磨损颗粒诱导骨溶解反应的安全性和有效性。 方法：(1)设计3条靶向TNF-α的siRNA，构建siRNA表达载体；构建siRNA重组慢病毒并转染小鼠巨噬细胞株RAW264.7，采用RealtimePCR和Western blotting检测干扰效率，筛选出最高效序列。(2)进行携带最高效靶向TNF-α siRNA序列的重组慢病毒(Lv-siRNA)的包装和生产。(3)建立改良小鼠植骨气囊模型；按照对照组、错配siRNA组(MS组)、TNF-α siRNA组(TNF-α组)通过气囊内局部注射进行生物学干预，转染后7天和14天取材。(4)取材前采用Xenogen IVIS50体内活体生物荧光成像系统检测活体小鼠GFP荧光及其分布情况；取小鼠外周血、肝、脾、肺、肾、脑组织，检测各器官内TNF-α表达。(5)检测颅骨-囊壁组织中TNF-α的mRNA和蛋白水平；检测颅骨.囊壁组织中IL-1β和IL-6的mRNA水平。(6)颅骨-囊壁组织HE染色观察炎症反应(囊壁厚度和炎性细胞计数)；TRAP染色检测破骨细胞生成；Van Gilson染色检测骨胶原含量。 结果：(1)成功构建siRNA表达载体；筛选出5’-GTGCCTATGTCTCAGCCTC-3’为最高效序列，干扰效率达到85.32％。体外干扰效果持续至少8周。(2)成功构建携带最高效siRNA序列的重组慢病毒。(3)成功建立改良小鼠植骨气囊模型。TNF-α组和MS组可见明显GFP荧光，局限于气囊局部，荧光量升高约5倍(P<0.01)；外周血、肝、脾、肺、肾、脑组织中TNF-α表达均无差异(P>0.05)。(4)TNF-α组中颅骨.囊壁组织TNF-α的mRNA和蛋白水平均显著降低(P<0.01)；TNF-α组中IL-1β和IL-6的mRNA水平均显著降低(P<0.01)。体内干扰效果持续至少2周。(5)HE染色显示TNF-α组囊壁厚度显著降低(P<0.05)，炎性细胞计数显著减少(P<0.01)，炎症反应被抑制；TRAP染色显示TNF-α组破骨细胞生成显著减少(P<0.05)；Van Gilson染色显示TNF-α组骨胶原丢失率显著降低(P<0.05)。 结论：(1)改良小鼠植骨气囊模型是研究磨损颗粒诱导炎症反应和骨溶解的理想动物模型。(2)应用RNA干扰技术在体外和体内同时抑制TNF-α表达是切实可行。(3)在改良小鼠植骨气囊模型内局部应用慢病毒介导靶向TNF-α siRNA能有效抑制磨损颗粒诱导骨溶解反应，且没有系统性副作用。

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文摘

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论文说明：缩略词表

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第一章引言

第二章siRNA表达载体和靶向小鼠INF-αsiRNA重组慢病毒的构建

2.1材料与方法

2.2结果

2.3讨论

2.4本章结论

参考文献

第三章在RAW264.7细胞中进行慢病毒介导最高效靶向TNF-α基因siRNA序列的筛选

3.1材料与方法

3.2结果

3.3讨论

3.4本章结论

参考文献

第四章改良小鼠植骨气囊模型的构建

4.1材料与方法

4.2结果

4.3讨论

4.4本章结论

参考文献

第五章局部应用靶向INF-α的siRNA抑制磨损颗粒诱发骨溶解

5.1材料与方法

5.2结果

5.3讨论

5.4本章结论

参考文献

致谢

攻读博士学位期间发表的学术论文