应用RNA干扰技术双通道下调bcl-2和cyclinD1基因增强耐药骨肉瘤化疗敏感性的研究

摘要

骨肉瘤是儿童和青少年最易罹患的原发性恶性骨肿瘤。尽管近30年来包括新辅助化疗在内的骨肉瘤治疗方案取得了长足进步,近年来骨肉瘤的整体存活期还是进入了平台期。骨肉瘤对于化疗不敏感,是导致预后不佳及低存活率的重要因为。多数化疗药物通过多种凋亡途径诱导肿瘤细胞死亡,因此抑制变异的抗凋亡基因,有望成为逆转包括骨肉瘤在内的多种恶性肿瘤化疗耐药的有效方法。
　　 Bcl-2是公认的原癌基因,抑制线粒体内的细胞色素C释放入胞浆,阻断Apaf1介导的caspase9的活性,从而抑制凋亡的发生。在多种恶性肿瘤中Bcl-2过表达,抑制细胞的正常凋亡,因而参与肿瘤发生及恶性肿瘤细胞耐药。我们设想,在包括骨肉瘤在内的多种肿瘤中,抑制Bcl-2的表达可以降低Bcl-2/Bax的比值,诱发细胞凋亡并抑制其增殖,从而干扰肿瘤的发生,并可以增强化疗药物的细胞毒性。
　　 Cyclin D1是调控细胞增殖的关键因子,在控制细胞由G1期向S期转换过程中起重要作用。Cyclin D1也被认为是一种癌基因,在促进细胞恶性转化过程中可起重要作用,包括加速细胞增殖,血管生成和抑制凋亡过程。Cyclin D1在骨肉瘤细胞增殖过程中也起到重要作用。所以我们也选择其作为基因抑制治疗骨肉瘤的一个靶基因。
　　 我们采用慢病毒载体介导RNA干扰技术来验证我们的设想,即同时沉默人骨肉瘤MG63耐药细胞中Bcl-2和Cyclin D1基因的表达,可以增强其对于化疗药物阿霉素的敏感性。
　　 我们在实验中把一种经过长期阿霉素作用培养出的一种MG63耐药细胞株(MG63/DXR)作为研究目标。MG63/DXR细胞已经被证实的重要耐药机制是其多药耐药基因(MDR1)的蛋白产物p糖蛋白表达上调。我们证明经过长期阿霉素作用后,MG63/DXR细胞内的Bcl-2和Cyclin D1基因表达也上调。我们成功建立了分别或联合稳定转染Bcl-2 siRNA和Cyclin D1 siRNA的MG63/DXR细胞株。有趣的是,荧光实时PCR和蛋白免疫电泳均证实Bcl-2 siRNA和CyclinD1 siRNA之一均能导致Bcl-2和Cyclin D1两种基因的表达抑制。实验中还发现经Bcl-2基因抑制后,Bax基因上调,导致Bcl-2/Bax比值下调显著。我们在Bcl-2和Cyclin D1抑制组细胞内均测得MDR1表达下降,这也会使得细胞对于化疗药物敏感性增强。本实验采用MTT法和流式细胞术测定各株细胞的IC50半数抑制药物(阿霉素)浓度和凋亡率,证实同时在多药耐药的人骨肉瘤MG63/DXR细胞内抑制Bcl-2和Cyclin D1,较之单基因抑制能更加有效逆转其耐药性。
　　 我们在实验中采用了慢病毒载体作为转染工具。我们的实验结果细胞株内高效地调节靶基因的表达。
　　 综上所述,我们的实验工作证明,慢病毒载体转染介导的RNA干扰技术高效抑制了人骨肉瘤MG63耐药细胞株内Bcl-2和Cyclin D1基因的表达,在体外显著逆转了肿瘤细胞对于阿霉素的耐药性,联合抑制癌基因表达是拮抗肿瘤的有效手段。

目录

文摘

英文文摘

英文缩略词索引

第一章 针对人Bcl-2基因和细胞周期素D1基因的siRNA重组载体的构建

前言

材料与方法

1 主要试剂

2 主要仪器

3 细胞

4 设计并合成针对目的基因的siRNA序列

5 有效siRNA序列的筛选

6 进行慢病毒颗粒的包装和生产

7.病毒滴度的测定

结果

1 PCR鉴定构建阳性克隆

2 构建质粒测序鉴定结果

3 重组质粒DNA琼脂糖凝胶电泳

4 质粒DNA纯度和浓度

5 RNA样品纯度和浓度

6 琼脂糖凝胶电泳检测RNA

7 Real-time PCR产物鉴定

8 Realtime PCR定量结果分析

9 慢病毒颗粒的包装和生产结果

10 病毒滴度的计算及调整结果

讨论

本章小节

参考文献

第二章 Bcl-2和Cyelin D1siRNA载体单独或联合转染人骨肉瘤MG63耐药细胞及其沉默基因效应的检测

前言

材料与方法

1 主要耗材和试剂

2 主要仪器

3 最佳MOI值的确定

4 MG63(N)细胞感染

5 稳转细胞株检测(RealTime-PCR)

6 稳转细胞株检测(western blof)

结果

1 活细胞、荧光计数

2 稳定表达细胞株的照片

3 Real Time PCR检测结果

4 Western blot检测结果

讨论

本章小节

参考文献

第三章 Bcl-2和Cyclin DlsiRNA重组慢病毒载体转染人骨肉瘤MG63耐药细胞逆转耐药性

前言

材料与方法

1.主要耗材和试剂

2 主要仪器

3 实验分组

4 流式细胞技术检测细胞周期

5 Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡

6 细胞化疗药物半数抑制浓度的测定

结果

1 稳定转染对MG63细胞周期影响

2 稳定转染与阿霉素联合作用对MG63细胞凋亡的影响

3 稳定转染对MG63耐药细胞IC50(阿霉素)的影响

讨论

本章小节

参考文献

综述:凋亡机制异常导致肿瘤耐药的研究进展

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文及参与课题目录

致谢