槲寄生凝集素功能域蛋白的研制与其生物学功能的初步研究

摘要

槲寄生(Mistletoe) 在中国用于治疗淋病、抗风湿、降血压已有悠久的历史，由于其具有独特的生物学作用引起了人们的广泛关注。槲寄生凝集素（Mistletoe Lectin, MLs）是槲寄生的一种有效成份。纵观国际研究进展： 欧洲、韩国、日本均有文献报道了当地MLs的生物学作用，如诱导细胞凋亡、促进淋巴细胞分泌炎症因子以及体内外免疫调节作用等。综合其令人关注的特性表明，MLs除了具有天然抗感染与直接的诱导细胞凋亡和细胞毒作用外，其间接的免疫调节作用在拮抗肿瘤中预示着极大的理论临床应用前景。
　　 本研究一直跟踪和研究中国槲寄生的独特的医药作用，并用经典生化方法提取并纯化了槲寄生凝集素蛋白（MLsP），通过传统的染色技术、流式细胞术、MTT等法分析了该蛋白诱导肿瘤细胞凋亡的形态特征，AP峰值和拮抗肿瘤细胞增殖等生物学效应以研究其诱导肿瘤细胞凋亡的病理免疫学机制。结果表明：MLsP具有诱导肿瘤细胞凋亡和显著抑制和阻断肿瘤细胞增殖的作用，并以Caspase依赖的方式发挥其有效的抗肿瘤作用。为了获得大量和稳定的MLsP，本文旨在运用分子生物学技术构建了PET28a-MLP表达载体，利用大肠杆菌原核表达系统，成功表达和制备了MLs功能域蛋白MLP，经纯化后对其进行了初步理化性质和生物学特性分析证明：大肠杆菌原核表达系统表达和制备的功能域蛋白MLP的得率为 100ug/ml，其分子量约为31KD，HPLC和2D gel显示纯化后的MLP与欧洲标准品吸收峰值基本一致，其等电点PI≈7.8。经初步免疫学功能检测发现其与欧洲标准品功能比对具有一定的诱导 γδ-T细胞扩增特性和微弱的细胞凋亡等作用，其诱导与拮抗肿瘤细胞凋亡和增殖的剂量依赖相关性的研究正在进一步的实验中。
　　 本文在完成上述工作的同时还参与了课题组承担的上海市科委重点项目《07JC14033IFN-β/TCRBV肽段干预RA免疫调节机制的研究》中B细胞介导类风湿性关节炎（Rheumatoid Arthritis- RA）部分的研究。研究发现：RA患者除了体内存在异常活化的自身反应性T细胞-Th1所造成的免疫损伤外还与患者Th2细胞（IL-4，IL-4受体，STAT-6水平）异常的免疫应答功能紊乱有关。实验证明RA患者由于Th2细胞表达和功能异常从而使其B细胞的数量（CD19+细胞）和功能发生质的变化，本文通过荧光定量PCR方法检测到的RA患者PBMC中ERK基因的相对表达量比正常对照高，而磷酸化IKK-a、IkB-a及NF-kB（p65）的表达水平具有一定意义的变化，因此从信号分子角度提示B细胞数量和功能的异常恰恰解释了RA患者T细胞功能的紊乱直接影响B细胞的免疫学功能，而患者体内被检测到的自身抗体谱和炎症细胞因子无疑进一步证明了B细胞积极参与RA患者自身免疫损伤的免疫学机制。

目录

前言

第一部分槲寄生凝集素的研制与生物学功能分析

第二部分：自身反应性B细胞在类风湿性关节炎中致病机制的初步研究

全文小结

参考文献：

附录

攻读学位期间参与学术论文及科研项目

已发表综述：类风湿性关节炎与自身反应性B细胞

致谢

论文说明:缩略词表

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