骨髓基质干细胞治疗山羊放射性颌骨坏死的实验研究

摘要

目的:研究放射线对成骨细胞细胞增殖、细胞周期以及分化相关基因的影响；观察骨髓基质干细胞(BMSCs)介入治疗山羊下颌骨放射性骨坏死(ORN)的效果和可能性。
　　 方法：1、山羊BMSCs体外通过条件培养液向成骨细胞诱导培养,通过成骨细胞鉴定后,采用RT-PCR和Realtime-PCR方法检测细胞诱导后成骨分化相关基因的表达变化。采用6MV直线加速器对小鼠胚胎成骨细胞系MC3T3-E1给予2、4、8 Gy的照射,通过MTT法和克隆形成实验检测照射后成骨细胞的增殖能力的变化,通过流式细胞仪检测细胞照射后对细胞周期的影响,通过RT-PCR和Realtime-PCR检测成骨细胞分化相关基因ALP、OCN、COLⅠ的表达变化。
　　 2、将山羊根据照射剂量分3组:15 Gy、20 Gy、25 Gy组,每组2只,采用6MY直线加速器对山羊下颌骨按分组剂量行单次照射,并在照射后行拔牙术,通过临床检查、影像学和病理学对模型进行检测。
　　 3、通过复合GFP逆转录病毒的包装细胞PG13生产含GFP基因的病毒液,直接感染山羊BMSCs,经过嘌呤霉素筛选后通过荧光显微镜观察转染后GFP的表达,通过流式细胞仪检测其转染率。
　　 4、将体外扩增培养山羊1×107 BMSCs通过DSA超选择导入ORN山羊动物模型下牙槽动脉分布区域,3个月后通过组织病理学观察其病理改变,采用Realtime-PCR检测成骨分化相关基因的变化。
　　 结果：1、BMSCs诱导后2周出现钙结节,ALP、OCN、COLⅠ免疫组化染色阳性,诱导后OCN和COLⅠ基因在表达上调。MC3T3-E1细胞照射后细胞增殖速度明显减慢,细胞周期出现G2/M期阻滞,8 Gy组部分细胞凋亡。照射后7 d,4 Gy、8 Gy组ALP、COLⅠ、OCN基因表达均上调,照射后21 d,4 Gy组和8 Gy组上述基因表达下调。
　　 2、山羊颌骨经过照射+拔牙后,25 Gy组3月内死亡,20 Gy组6个月后出现典型的ORN临床症状,15 Gy组一年内未出现临床症状,3组病理均符合ORN的诊断,SPECT/CT检测照射侧颌骨代谢降低,影像学未见明显骨质改变。
　　 3、BMSCs通过病毒液转染后GFP表达率仅为11.5％,通过筛选后表达率上升至78.8％,但大部分细胞死亡。
　　 4、山羊ORN动物模型经过BMSCs治疗3月后,治疗组和ORN组病理上无明显变化,分化相关基因表达无明显差异。
　　 结论：成功将骨髓基质干细胞向成骨细胞方向诱导分化,诱导后成骨细胞分化相关基因表达上调；照射对成骨细胞增殖有抑制作用,并使细胞周期出现G2/M期阻滞,8 Gy照射能引起细胞凋亡；MC3T3-E1细胞经过4 Gy以上照射剂量7 d后成骨细胞分化相关基因表达上调,21 d后基因表达下调；骨髓基质干细胞成功标记GFP,但因转染率偏低而应用受限；成功建立ORN山羊动物模型,6MV直线加速器单次照射20 Gy是较为理想的建模剂量；骨髓基质干细胞血管介入治疗山羊ORN3个月后,组织病理和分化相关基因表达无明显变化。

目录

文摘

英文文摘

缩略语表

前言

第一章放射线对成骨细胞增殖、细胞周期及分化相关基因的影响

第一节骨髓基质干细胞向成骨细胞诱导分化的实验研究

第二节放射线对成骨细胞增殖、细胞周期及成骨细胞分化相关基因的影响

本章小结

第二章下颌骨放射性骨坏死山羊动物模型的建立

第三章骨髓基质干细胞治疗山羊ORN的初步实验研究

第一节骨髓基质干细胞的GFP标记

第二节骨髓基质干细胞治疗山羊ORN的初步实验研究

本章小结

全文结论

进一步研究方向

参考文献

致谢

攻读博士学位期间发表的学术论文