一种基于AgRP为框架结构的新的肿瘤分子显像探针

摘要

目的：
　　 本研究通过将含4对二硫键的AgRP(Agouti-related Protein)作为框架结构的基础,用含Arg-Gly-Asp(RGD)的9个氨基酸序列肽段(XXRGDXXXX)取代AgRP原有的6个氨基酸肽段。通过对RGD两侧氨基酸残基的饱和诱变,生成了一个数量为五百万的AgRP突变体库。通过酵母菌表面展示的方法,筛选出与整合素αvβ3受体结合具有高亲和性的AgRP突变体(见图1)。本研究中,选取AgRP突变体7C和6E进行放射性核素111In和64Cu的标记,进行小动物显像、细胞摄取、体外稳定性等试验,探讨以AgRP框架结构为基础来制备肿瘤分子显像剂的可行性。
　　 方法：
　　 通过固相肽段合成法和氧化折叠反应制备AgRP突变体AgRP-7C和AgRP-6E,DOTA位点特异性偶联到AgRP突变体肽段的N末端。DOTA-AgRP-7C、DOTA-AgRP*6E分别与111InCl3在醋酸铵缓冲液(pH5.5)中,80℃共同孵育45分钟后分离纯化,得到显像剂111In-DOTA-AgRP-7C、111In-DOTA-AgRP-6E。体外稳定性试验和细胞摄取试验,以及荷人神经胶质瘤(U87MG细胞株)裸鼠体内生物学分布试验等来评估以上显像剂的应用。
　　 DOTA-AgRP-7C与64CuCl2在醋酸钠缓冲液(pH5)中,37℃共同孵育1 h后分离纯化。标记后的显像剂64Cu-DOTA-AgRP-7C用于荷人神经胶质瘤裸鼠体内生物学分布,小动物正电子发射计算机成像技术、以及体内外代谢稳定性等试验的研究。
　　 结果：
　　 DOTA-AgRP-7C、DOTA-AgRP-6E易于被放射性核素111In标记,放射化学产率～50％,放射化学纯度均>90％。体外稳定性试验表明,111In-DOTA-AgRP-7C和111In-DOTA-AgRP-6E稳定性良好。与111In-DOTA-AgRP-6E相比111In-DOTA-AgRP-7C显示了更好的肿瘤摄取和更长的肿瘤滞留时间,0.5 h和24 h的肿瘤摄取率分别为5.74±1.60％ID/g和1.29±0.02％ID/g,这与体外细胞摄取试验的结果一致。此外,同时注射大量过剩的c(RGDyK),特异性抑制肿瘤对显像剂111In-DOTA-AgRP-7C的摄取。
　　 64Cu标记DOTA-AgRP-7C的放射化学产率～46％,放射化学纯度>99％。体内生物学分布和小动物PET试验的结果表明,64Cu-DOTA-AgRP-7C显示出血浆清除迅速、肿瘤渗透好、肿瘤滞留率高、肿瘤/本底比值高,其中2 h和24 h的肿瘤摄取率分别为2.70±0.93％ID/g和2.374±1.04％ID/g。抑制试验表明,大量过剩的c(RGDyK)可断肿瘤组织对显像探针64Cu-DOTA-AgRP-7C的摄取,证实64Cu-DOTA-AgRP-7C靶向αvβ3整合素受体的高度特异性。血清稳定性试验和体内代谢稳定性试验表明,AgRP-7C不易被蛋白酶水解,稳定性良好,可用于体内分子显像的研究和应用。
　　 结论：
　　 放射性核素标记的AgRP突变体7C,具有很大的潜力应用于表达αvβ3整合素受体的肿瘤的SPECT或PET显像。本研究结果证实了以AgRP框架结构为基础,发展靶向其他肿瘤受体的显像剂的可行性；同时也证明了以AgRP这类“半胱氨酸结”结构为基础,研发肿瘤分子显像剂的可行性。

目录

文摘

英文文摘

图表清单

符号清单

前言

第一部分

材料与方法

结果

讨论

第二部分

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

附录1

致谢

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