基于Tie2的抗肿瘤及新生血管靶向药物输送系统研究

摘要

肿瘤是一类严重威胁人类生命的恶性疾病，其原因在于人体自身细胞因为受到各种内在与外界因素的影响，失去正常的生长调节而造成增殖失控。常规的治疗手段包括手术切除，放射治疗，化学治疗，介入治疗，生物治疗等等。但是由于常规的治疗手段缺乏特异性，在杀伤肿瘤组织的同时也作用于正常组织细胞，造成极大的毒副作用，因此肿瘤特异的靶向药物输送尤显重要。
　　由长循环脂质体系统载化疗药物被研究多年，由于其能够通过EPR效应被动靶向肿瘤组织，减少毒副作用，同时能够在循环系统中保护药物不被降解，延长体内循环时间，因而得到人们的重视。在此基础上，如果能够通过肿瘤上特异性标志物的识别，实现脂质体的肿瘤主动靶向，将能够进一步的提高化疗药物的疗效。
　　Tie2蛋白是一种受体酪氨酸激酶，其在肿瘤诱导的血管新生过程中起着重要的作用。Tie2蛋白在肿瘤新生血管内皮细胞中表达水平会大大提高，同时Tie2还被部分肿瘤细胞所表达。因此，我们以Tie2为靶点，设计肿瘤靶向的脂质体药物输送系统。
　　靶向药物输送系统的关键在于肿瘤特异性标记物的靶向配体的筛选，由于小分子多肽具有多样性高，免疫原性低，制备简单，成本低廉，结构稳定等多种优点，我们选择了采用噬菌体固相筛选技术，Autodock对接评估计算机辅助药物设计技术以及天然配体Angiopoietin-2受体结合结构域结构分析等多种手段，筛选出能够与Tie2蛋白特异性结合的候选多肽配体PH1及An1，并利用表面等离子共振技术，验证了其与Tie2蛋白的结合能力，并计算亲和常数。
　　为了验证多肽引导脂质体药物输送系统靶向分布的潜力，我们通过连接剂SPDP，利用巯基与马来酰亚胺基的特异性反应，将多肽偶联到DSPE-PEG的聚乙二醇末端，并利用高效液相色谱分析连接产物。我们利用后插入技术，将PH1-PEG-DSPE胶束溶液与脂质体(HSPC∶Chol∶DSPE-PEG=2∶1∶0.1)共孵育，制备靶向脂质体。
　　在体外细胞试验中，通过细胞ELISA技术，激光共聚焦显微镜技术以及流式细胞术，利用对照多肽PH2，GE11偶联的脂质体以及普通长循环脂质体作为对照，我们发现PH1偶联的脂质体能够靶向Tie2蛋白高表达的肿瘤细胞以及血管内皮细胞，而对Tie2阴性表达细胞结合较低。利用PH1偶联载化疗药物顺铂的长循环脂质体，可以大大的特异性提高顺铂脂质体对Tie2阳性细胞的毒杀作用。除了化疗药物输送系统，我们还针对PH1靶向的基因输送系统进行了研究，通过PH1偶联修饰以及局部超声促进基因转染，达到靶向基因输送的目的，在体外细胞试验中得到一定的效果。
　　与体外系统相比，体内环境远远复杂，多肽与受体的结合受到一系列生理及病理因素的影响。我们将荧光分子Cy5.5偶联于多肽An1以及PH1靶向脂质体，利用小动物活体光学成像技术考察了多肽PH1与An1在体内的靶向行为。我们发现两多肽能够明显的提高肿瘤组织的荧光分布。通过硫酸铵梯度法，我们将广谱化疗药物阿霉素包封进靶向脂质体，PH1的修饰能够提高阿霉素在肿瘤部位的有效浓度，提高了对肿瘤生长的抑制作用。

目录

声明

摘要

第一章 综述

1．血管新生简介

1．1 概述

1．2 肿瘤血管新生

1．3 视网膜血管新生

1．4 血管新生相关分子信号系统

1．5 血管新生的特点及治疗

2 脂质体技术

2．1 纳米技术

2．2 脂质体

3 抗肿瘤及抗肿瘤新生血管的靶向治疗

3．1 分子靶向治疗

3．2 载体靶向药物运输

第二章Tie2配体多肽筛选

1．前言

1．1 噬菌体展示技术

1．2 计算机虚拟筛选

1．3 天然配体结合域结构分析

1．4 表面等离子共振技术

2．材料与方法

2．1 材料与仪器

2．2 实验方法

3．试验结果

3．1 Tie2／Fc融合蛋白噬菌体库筛选结果

3．2 根据Angpoietin 2-Tie2结合区域关键氨基酸位点选取Tie2结合多肽

3．3 计算机模拟计算多肽配体与Tie2对接能量

3．4 利用表面等离子共振(SPR)技术体外验证多肽与Tie2蛋白结合，并测量亲和常数

4．分析与讨论

第三章 PH1与Tie2体外特异性结合及靶向药物输送试验

1．前言

2．材料与方法

2．1 材料与仪器

2．2 实验方法

3．实验结果

3．1 噬菌体-细胞ELISA试验

3．2 多肽-脂质连接

3．3 脂质体表征

3．4 肿瘤细胞中Tie2蛋白表达水平

3．5 激光共聚焦显微镜考察PH1多肽修饰的脂质体与细胞的结合

3．6 利用流式细胞分析仪考察PH1多肽修饰的脂质体与细胞的结合

3．7 顺铂靶向脂质体的性质以及对肿瘤细胞的体外毒性研究

3．8 顺铂靶向脂质体对Tie2阳性的脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)毒性研究

3．9 PH1多肽对脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)的丝裂原性考察

4．讨论与分析

第四章 PH1介导靶向及超声促进基因转染

1．前言

2．材料与方法

2．1 材料与仪器

2．2 试验方法

3．实验结果

3．1 DOTAP／CDAN基因转染效率研究

3．2 PH1靶向介导基因转染研究

3．3 氢离子透过性试验

3．4 含气脂质体气态二氧化碳检测

3．5 冰冻透射显微镜观察

3．6 超声促进基因转染研究

4．讨论与分析

第五章 多肽及多肽修饰脂质体体内靶向试验

1．前言

2．材料与方法

2．1 材料与仪器

2．2 实验方法

3．实验结果

3．1 An1-Cy5.5偶联标记

3．2 小动物光学活体成像系统测量An1-Cy5.5荧光分子的体内分布

3．3 小动物光学活体成像系统测量PH1修饰的Cy5.5荧光脂质体体内分布

3．4 多肽修饰的阿霉素脂质体粒径及分布(PCS图)

3．5 大鼠体内阿霉素半衰期考察

3．6 阿霉素脂质体小鼠体内分布考察

3．7 阿霉素脂质体在荷瘤裸鼠体内药效考察

4．讨论与分析

附录

第六章 总结与展望

1 研究主要内容

2 创新点

3 研究展望

参考文献

致谢

攻读博士学位期间发表论文情况