超广谱β-内酰胺酶在社区人群中的流行及碳青霉烯类耐药产酸克雷伯菌的耐药机制

摘要

抗生素的大量使用在起到治疗感染的同时，也间接地选择出了耐药的菌株，并引起广泛播散。耐药菌株的流行不但会影响用药者的治疗效果，而且还会造成严重的社会影响。一直以来，耐药监控的重点都是医疗机构，而社区人群中耐药菌的流行状况则很少有人关注。事实上，社区人群是一个不容忽视的群体，其在耐药基因和耐药菌的存储和播散环节上起着重要作用。大肠埃希菌(Escherichia coli，E.coli)是人类和动物肠道中的一种重要的需氧和兼性厌氧菌。通常情况下，人群肠道E.coli的耐药情况可以反映社区耐药基因流行状况。
　　 产超广谱β-内酰胺酶(Extended-spectrumβ-lactamases，ESBLs)是革兰阴性菌中最为常见的一种耐药机制。为了了解ESBLs在社区人群中流行的状况，本课题对社区人群肠道E.coli中ESBLs流行状况及其播散机制进行了研究。同时，对期间从一位住院患者粪便中分离到一株碳青霉烯类抗生素耐药的产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca，K。oxytoca)，本课题也对该菌进行了深入的研究，以阐明其耐药形成的机制。本课题内容共包括以下两个部分：
　　 一、超广谱β-内酰胺酶在社区人群中的流行
　　 目的：研究社区人群肠道E.coli中ESBLs的流行状况及播散机制。方法：从福建医科大学附属医院健康体检中心2009年1月～5月收集健康体检者粪便标本，筛选ESBLs阳性的E.coli菌株，协同纸片法确认产ESBL，纸片扩散法检测其药敏情况；PCR扩增各型ESBL基因、上下游调控序列、整合子、系统分型基因、质粒不相容性分型基因和E.coli ST131特异性基因。质粒接合试验验证耐药基因的转移性；PFGE对ESBL阳性菌株进行分型。结果：共从109例健康人粪便标本中分离出55株(50.5％)产ESBLs的E.coli。菌株对三代头孢类抗生素的敏感率差异很大，其中大约85％的菌株对头孢他啶敏感，而对头孢噻肟全部耐药。PCR检测共从31株细菌测出blaTEM，经测序皆为blaTEM-1；另外OXA-1阳性菌株有3例。所有菌株都检出blaCTX-M，其中CTX-M-9组ESBLs菌株有41例，其中以blaCTX-M-14为主；CTX-M-1组ESBLs菌株检出16例，大部分为blaCTX-M-15型。共有90.0％(50/55)的菌株携带的blaCTX-M上游检出ISEcp1序列，而只在1株细菌blaCTX-M上游检出IS26。E.coli检出4株ST131克隆株。45株E.coli接合试验成功，其余10株经电转化试验，获得8株转化子。可接合性质粒分型：82.2％(37/45)的接合性质粒成功分型；共检出7种不同类型的质粒，其中IncFIB和Inc I1阳性率最高。经电转化获得的8株转化子提取的质粒共有7株分型成功。其中IncFIA型质粒4例，IncFIB型质粒2例，和IncB/O型质粒1例。E.coli系统分型以A和D型占多数；另外在B2型E.coli中检出4株ST131克隆株。PFGE分型结果显示ESBL阳性菌株为非克隆传播，且首次发现E.coli ST131克隆株定植于健康人肠道内。结论：社区人群肠道E.coli中ESBLs基因具有携带率高、易转移性和非克隆传播三个特点。
　　 二、碳青霉烯类耐药产酸克雷伯菌的耐药机制
　　 目的：探讨一株耐碳青霉烯类药物K.oxytoca耐药机制。方法：纸片扩散法和E-test检测待检菌株及其接合子、重组子对13种抗生素的MIC值；PCR检测各种耐药基因；改良Hodge试验和组合纸片法检测菌株产碳青霉烯酶情况；质粒接合试验验证耐药决定因子的可转移性；随机克隆法研究耐药基因的基因环境；Southern blot对耐药基因进行定位提取外膜蛋白，分析其在耐碳青霉烯类抗生素中的作用。结果：该菌除了对环丙沙星的MIC=0.75μg/ml外，其余12种抗生素的MIC均>32μg/ml；改良Hodge试验提示菌株产碳青霉烯酶；组合纸片法显示菌株可能产KPC和MBL两种酶；PCR检测出KPC-2和IMP-8两种基因；克隆试验发现blaKPC-2的基因环境大致为ISKpn8-truncated blaTEM-blaKPC-ISKpn6结构，而blaIMP-8的基因环境大致为IS26-IntI1-blaIMP-8-aacA4-tniC结构。Southern blot试验表明blaKPC-2定位于一个大小约为54kb的接合性质粒上，而blaIMP-8定位于一个大小约180kb的接合性质粒上。SDS-PAGE电泳显示菌株存在膜孔蛋白的缺失。结论：首次发现同时携带KPC和IMP两种类型碳青霉烯类耐药基因的革兰阴性菌，并且blaKPC和blaIMP定位于不同的可接合性质粒上。