Dlx2基因在MC3T3-E1细胞成骨分化及周期调控中的作用研究

摘要

目的：①检测歧异同源盒基因Dlx 家族在MC3T3-E1 细胞成骨分化中的表达谱，筛选与成骨分化相关性密切的Dlx 家族成员作为候选研究基因。②探讨候选研究基因过表达对MC3T3-E1 细胞成骨分化的调控作用。③探讨候选研究基因过表达对MC3T3-E1 细胞周期和凋亡的影响。
　　 方法：首先建立MC3T3-E1 细胞诱导成骨分化模型，采用real-time RT-PCR方法鉴定内源性Dlx 基因家族6 个成员在成骨分化不同时期的表达谱，筛选出与成骨分化趋势相关性大的Dlx 基因成员（本研究中发现的是Dlx2 基因）。然后构建Dlx2 过表达的逆转录病毒载体，测序验证。体外病毒转染MC3T3-E1 后，以嘌呤霉素行抗性筛选稳定细胞株, 建立稳定过表达Dlx2 基因的MC3T3-E1-Dlx2 细胞成骨分化模型，并以RT-PCR 和Western Blot 检测转染后细胞中Dlx2 的表达谱。接下来，在稳定过表达Dlx2 基因细胞模型中，应用real-timeRT-PCR 检测Dlx2 过表达对部分成骨相关基因（ALP，OCN，Runx2，Msx2）表达的影响；以碱性磷酸酶（ALP）活性测定和茜素红染色法检测Dlx2 过表达对成骨分化的影响；最后，分别利用PI/Rnase 和Annexin V/PI 染色后的流式细胞分选技术，检测Dlx2 基因过表达对细胞周期和凋亡的影响。
　　 结果：⑴确定Dlx 基因家族6 个成员在MC3T3-E1 细胞成骨分化不同时期细胞内的表达谱，发现Dlx2 基因与成骨分化趋势相关性较大，作为研究候选基因。⑵成功构建并鉴定获得Dlx2 过表达的逆转录病毒载体。该病毒载体体外转染MC3T3-E1 细胞后筛选出Dlx2 稳定过表达细胞株MC3T3-E1-Dlx2，其mRNA 和蛋白表达量明显高于对照组。在成骨诱导过程中，MC3T3-E1-Dlx2 细胞ALP 值在第4d、7d、14d 均高于对照组细胞，茜素红染色显示实验组较对照组和空白组染色深。Dlx2 过表达于成骨诱导早期就能显著促进ALP 和 Msx2 的表达（P＜0.05），晚期则上调OCN 表达（P＜0.05），而Runx2 表达无明显变化（P＞0.05）。⑶在Dlx2 基因稳定过表达细胞系MC3T3-E1-Dlx2 中，PI/Rnase 染色后流式细胞分选显示实验组较对照组G1/G0 期细胞比例增加（P＜0.05），S 期和G2/M期细胞比例减少（P＜0.05＝。Annexin V/PI 染色后的流式细胞分选显示实验组较对照组早期凋亡和晚期凋亡均有明显增加（P＜0.05）。
　　 结论：Dlx2 基因过表达上调ALP、OCN等成骨相关基因的表达，促进MC3T3-E1细胞的成骨分化。同时，Dlx2 基因过表达阻滞MC3T3-E1细胞的有丝分裂于G1/G0 期，促进分化，促进MC3T3-E1细胞凋亡。

目录

绪论

第1章Dlx基因家族在MC3T3-E1细胞成骨分化中的表达谱

第2章Dlx2基因过表达对MC3T3-E1细胞成骨分化的调控作用

第3章Dlx2基因过表达对MC3T3-E1细胞凋亡和周期的影响

全文总结

参考文献

附录：综述Dlx1/Dlx2基因对小鼠第一腮弓发育调控机制的研究发展

致谢

攻读硕士学位期间发表的学术论文

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