大鼠肥大细胞对心肌微血管内皮细胞血管新生功能的体外研究

摘要

肥大细胞(Mastcells，MCs)来源于骨髓多能干细胞，在外周循环中以少量的前体细胞形式存在，在MCs发育为成熟细胞前这些前体细胞可以表达Fc-ε-RⅠ和Fc-γ-RⅡ/Ⅲ，在干细胞趋化因子(stemcellfactor，SCF)作用下迁移到不同的组织并转变成为成熟的MCs。MCs是一种重要的免疫细胞，既往对MCs的研究主要集中于其在Ⅰ型超敏反应中的作用，但是进一步的研究发现MCs在自身免疫性疾病、外周耐受、先天性免疫适应中也发挥了重要的作用。近来的研究显示心脏组织中也存在MCs，活化的M℃s与动脉粥样硬化、心肌缺血、心脏移植后的纤维化、高血压、心肌病等多种心血管疾病有关。MCs多位于新生血管周围，研究已经证实MCs参于血管新生有关，在肿瘤的研究中显示肿瘤的恶性程度是与肿瘤新生血管富于侵蚀性有关的，而这些新生血管与MCs细胞数目是存在一定的关系。近期研究还发现MCs与肥胖或糖尿病有关，这也与MCs参与血管新生的过程有关。MCs可以产生、存储和释放多种血管新生物质，如:组胺、肝磷脂蛋白聚糖、类胰蛋白酶、类糜蛋白酶、多种生长因子和细胞活素类物质，这些物质在不同程度上参与了血管新生的过程。虽然体外和体内多项研究显示MCs是与血管新生有关的，但这些新生血管多表现为结构和功能的异常，而且这些血管易于出血和富于侵蚀性，这表明MCs可能与这些新生血管的功能障碍有关。虽然研究显示MCs分泌的多种物质参与血管新生的过程，但是类胰蛋白酶和类糜蛋白酶作为MCs的主要物质在血管新生过程中哪一个占主导作用未见相关报道。微血管内皮细胞(microvascularendothelialcells，MVECs)不仅是血管内的一层屏障，还具有活跃的合成细胞因子和各种活性物质参与机体多种生理功能调节的重要作用。研究显示血管新生过程是与MMVECs的增殖、迁移等过程密切相关的，因此MMVECs功能变化一直是血管新生的重点研究领域。本研究主要从MCs的主要两种物质类胰蛋白酶和类糜蛋白酶着手研究活化的MCs对各种情况下MVECs血管新生的影响。
　　本研究采用Wistar大鼠的心肌微血管内皮细胞(myocardialmicrovascularendothelialcells，MMVECs)和腹腔MCs在不同条件下共培养的方法，在体外比较MMVECs新生功能的改变。已有研究结果表明，促血管新生因子以及受体的异常表达和信号转导障碍是血管新生异常的重要原因。根据促血管新生因子和抑制因子平衡的理论，本研究从促血管新生的角度出发，比较MCs活化后对MMVECs上促血管新生因子和受体的表达变化，研究MCs对MMVECs血管新生的影响。实验主要分以下三部分:
　　第一部分:分别取80-100g和250gWistar大鼠采用植块法和梯度离心法培养MMVECs和MCs。通过CD31、CD34、Ⅷ因子和细胞形态鉴定MMVECs，通过甲苯胺蓝染色鉴定MCs。将MMVECs和活化后的MCs产物——MCGs进行共培养发现MCGs可以促进MMVECs细胞的增殖、迁移，而使用类胰蛋白酶抑制剂—TLCK和类糜蛋白酶—TPCK后这方面作用被削弱，而TLCK的抑制作用尤其明显。对Ang/Tie-2系统的进一步研究发现MCGs可以促进Ang-1mRNA表达而抑制Ang-2表达，对Tie-2则没有明显影响，但是我们并没有发现MMVECs表达Ang-1蛋白，而在MCGs作用下Ang-2表达降低，这样的作用可以被相关抑制剂逆转，而在TLCK中的作用尤其明显，我们研究显示类胰蛋白酶是MCs中主要的促血管新生物质，MCGs参与的新生血管的不成熟是与Ang-2/Tie-2系统失衡有关的。
　　第二部分:通过在不同糖浓度下MMVECs与MCGs共培养观察观察高血糖及MCGs单独存在及这两者共存时对MMVEC的血管新生能力的影响。探讨高糖情况下VEGF及受体表达的改变和Ang/Tie-2信号通路的改变。利用实时定量RT-PCR、Westernblot方法观察不同糖浓度下及MCGs存在时对MMVEC中VEGF、Flt-1、Flk-1、Ang-1、Ang-2和Tie-2mRNA及蛋白表达的调节。结果显示与低糖浓度下的MMVECs相比，虽然高糖环境下MMVEC中VEGFmRNA和蛋白的表达增加，但是由于其受体Flt-1、Flk-1mRNA及蛋白和Ang-1mRNA表达的下调，高糖浓度下血管新生的能力还是下降的。MCGs促进VEGF及相关受体、促进Ang-1mRNA表达，抑制Ang-2mRNA和蛋白的表达，从而促进血管新生。使用类胰蛋白酶抑制剂—TLCK抑制了血管新生的相关改变，而类糜蛋白酶抑制剂—TPCK虽然也可以抑制血管新生，但是其作用是显著弱于TLCK的，对高糖情况下的作用尤为明显。
　　第三部分:缺血缺氧环境下存在MCs自发性脱颗粒，为进一步探讨低氧环境下MCs对MMVECs血管新生功能的影响，本部分对MCs及MMVECs在OGD条件下细胞损伤功能进行了研究，发现MCs在第2小时起即可出现自发性脱颗粒现象，随着OGD时间的延长，活化的MCs数目在增多，MCs膜稳定剂—色甘酸钠(DSCG)可以稳定MCs膜结构减轻MCs的脱颗粒程度。MMVECs在第16小时起出现自身细胞的损伤。随着OGD的进展，VEGF和Ang-1的mRNA在第8小时达到峰值，自第16小时起VEGF及Ang-1mRNA表达呈显著的下降，VEGF的相关受体Flt-1和Flk-1mRNA自第2小时起即出现逐步下降趋势，而Ang-2mRNA表达随OGD的进展表达呈逐步增加的趋势，我们发现MCs和MCGs可以增加VEGF及其受体的表达，抑制Ang-2的表达，这在MCGs中尤为明显，这与MCGs的有较高的类胰蛋白酶和类糜蛋白酶浓度有关。但是随着OGD时间的延长血管新生能力还是下降的，主要与OGD对MMVECs的作用有关。
　　结论:肥大细胞可以促进MMVECs的血管新生，其主要与VEGF及相关受体表达上调及Ang-2表达降低有关。在高糖浓度下虽然存在活化的MCs，其血管新生能力还是弱于在低糖浓度下的MMVECs，VEGF在高糖浓度下表达增加但是由于其受体的下调，故其血管新生的能力还是下降的，这说明高糖对血管新生的影响是大于MCGs对MMVECs血管新生的影响的。在OGD情况下存在MCs的自身活化现象，我们发现随OGD时间的进展，VEGF和Ang-1表达在第8小时到达峰值后就开始显著的降低，而Ang-2表达则是一直增加，在MCGs或活化的MCs存在时，VEGF及相关受体、Ang-1表达增加，而Ang-2表达降低。从我们研究来看虽然MCs在不同条件下可以促进VEGF的表达，但MCs促进血管新生的能力是有一定限度的，而且这种新生的血管表现为不成熟不完整的，这与Ang-2/Tie-2信号通路的下调有关。

目录

声明

摘要

文中所用英文缩写及中英文对照

第一部分 大鼠心肌微血管内皮细胞和腹腔肥大细胞培养及微血管内皮细胞与肥大细胞共培养后血管新生功能的改变

引言

材料和方法

结果

讨论

参考文献

第二部分 高糖浓度下大鼠心肌微血管内皮细胞和肥大细胞共培养后血管新生功能的改变

引言

材料和方法

结果

讨论

参考文献

第三部分 低氧低糖条件下大鼠心肌微血管内皮细胞和肥大细胞培养后新生功能障碍的改变

引言

材料和方法

结果

讨论

参考文献

结论

肥大细胞在心血管疾病中的机制研究

致谢

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