重组腺相关病毒经圆窗膜途径转导豚鼠耳蜗的实验研究

摘要

第一部分胶原酶对豚鼠听觉功能及圆窗膜结构的影响
　　目的:观察圆窗龛放置Ⅰ型胶原酶对豚鼠听觉功能及圆窗膜结构的影响，旨在探索在不引起实验动物听力及圆窗膜形态不可逆性损伤的前提下，胶原酶的最佳作用浓度、剂量及时间。
　　方法:经全频程听性脑干反应测试选取听力正常的健康豚鼠39只，随机分为急性实验组及慢性实验组。急性实验组3只豚鼠，Ⅰ型胶原酶作用于圆窗膜后立即取材，以透射电镜和扫描电镜观察圆窗膜的结构改变。慢性实验组36只豚鼠，按胶原酶浓度(30mg/ml-50mg/ml)、作用时间（5min或10min）及剂量(5μl或10μl)的不同组合分为12亚组，每组3只豚鼠。每只豚鼠双耳给予胶原酶作用不同时间后吸出剩余液体并冲洗。术后4周，每周行听性脑干反应测试，最后一次测试结束后取材，用透射电镜和扫描电镜观察圆窗膜结构改变。
　　结果:术后4周，取材时未见明显中耳炎症和中耳腔内出血等反应。30mg/ml浓度、5μl的Ⅰ型胶原酶作用于圆窗膜10分钟对豚鼠圆窗膜造成不同程度的急性损伤，扫描电镜下见圆窗膜表面散在大小不等的裂隙状破损，严重区域见上皮细胞部分游离，细胞表面以及紧密连接带状区微绒毛稀少或消失。透射电镜下见各层细胞之间排列松散，细胞间隙增宽。50mg/ml及40mg/ml浓度的胶原酶作用于圆窗膜，无论总剂量或作用时间如何，均会导致不可逆的听觉功能损失，30mg/ml浓度的胶原酶在总剂量达到10μl时也是如此。而30mg/ml浓度、总剂量为5μl的Ⅰ型胶原酶放置于圆窗膜，作用5min或10min均对豚鼠造成一过性ABR阈值升高，各频率平均阈值升高达5～20dB，4周后实验动物ABR阈值均恢复至术前水平，透射电镜及扫描电镜下见圆窗膜形态亦基本恢复正常。
　　结论:30mg/ml浓度、5μl的剂量，5～10分钟作用时间，圆窗龛放置Ⅰ型胶原酶可一过性改变圆窗膜的结构，提高圆窗膜通透性，并引起相应的听觉功能障碍，而上述浓度、剂量及作用时间的圆窗膜胶原酶处理对豚鼠听觉功能及圆窗膜结构并无不可逆影响，术后4周，豚鼠听觉功能及圆窗膜结构恢复至术前水平。
　　第二部分改良重组腺相关病毒载体提高目的基因在耳蜗局部转染效率的实验研究
　　目的:采用能够增强目的基因在耳蜗细胞内表达的CBA启动子，运用定点突变技术敲除重组腺相关病毒载体表面的酪氨酸残基以提高目的基因在耳蜗细胞的转染效率，并评估改良腺相关病毒载体的安全性。
　　方法:采用PCR技术克隆CBA启动子，通过定点突变技术敲除暴露于病毒表面的酪氨酸残基基因以构建改良的腺相关病毒载体。经全频程听性脑干反应测试（闭合声场给声，分别测试两耳的听力）选取听力正常的健康豚鼠18只，随机分为三组，每组6只动物，均经耳蜗切开途径双耳注射给药。A组注射生理盐水;B、C组分别注射改良及未经改良的腺相关病毒载体。术后每周测试听力，2周后处死动物取材，一耳行耳蜗基底膜铺片，免疫荧光染色，计数耳蜗毛细胞缺失及病毒转染效率;另一耳行蜗轴冰冻切片，荧光显微镜下观察、计数耳蜗螺旋神经节细胞缺失及病毒转染效率。
　　结果:术后2周改良AAV载体携带报告基因在耳蜗底回内、外毛细胞的转染效率分别高达90％及50％以上;未经改良的AAV载体在底回内毛细胞的转染效率在60％以上，外毛细胞转染效率较低，仅有7％左右，从底回到顶回转染效率逐渐降低，内毛细胞转染效率明显高于外毛细胞。耳蜗中轴冰冻切片荧光显微镜下观察结果显示:两种载体从耳蜗底回到顶回均可见报告基因在螺旋神经节细胞的高效表达，各回的转染效率均在80％左右。术后2周，三组实验动物听力与术前相比差异均无显著性意义，且耳蜗毛细胞及螺旋神经节细胞均无明显缺失。
　　结论:采用CBA启动子，通过定点突变技术敲除暴露于病毒表面的酪氨酸残基基因构建的改良腺相关病毒载体可显著提高目的基因在耳蜗细胞的转染效率，且安全可靠。
　　第三部分重组腺相关病毒经不同转导途径在豚鼠耳蜗转染效率的对比研究
　　目的:探讨重组腺相关病毒载体经耳蜗切开及胶原酶处理的圆窗膜途径转导豚鼠耳蜗的的可行性及安全性，为内耳基因治疗的进一步临床研究提供实验基础和理论依据。
　　方法:经全频程听性脑干反应(ABR)测试选取听力正常的健康豚鼠18只(36耳，随机分为3组，每组12耳，其中6耳给予携带EGFP基因的AAV载体(AAV-EGFP)，另外6耳给予改良的AAV-GFP载体（mutant AAV-GFP）。A组经完整圆窗膜途径，B组经耳蜗切开途径，C组则经5μl的30mg/ml胶原酶处理圆窗膜10分钟后给药。各组于术后2周行ABR测试后处死取材，半数耳行基底膜铺片，免疫荧光染色，计数耳蜗毛细胞缺失及病毒转染效率;另外半数耳行耳蜗中轴冰冻切片，荧光显微镜观察，计数耳蜗螺旋神经节细胞缺失及病毒转染效率。
　　结果:术后2周，经耳蜗切开及胶原酶处理的圆窗膜途径mutant AAV-GFP载体在耳蜗底回内、外毛细胞的转染效率均高达90％及50％以上;经耳蜗切开途径AAV-EGFP载体在耳蜗底回内毛细胞的转染效率达60％以上，外毛细胞转染效率较低，仅有7％左右，经胶原酶处理的圆窗膜途径AAV-EGFP转染效率则略低于耳蜗切开途径;无论是耳蜗切开途径还是胶原酶处理的圆窗膜途径，两种载体均实现了目的基因在螺旋神经节细胞高效稳定的转染，各回的转染效率均在80％左右;实验动物各频率ABR阈值与术前相比差异无显著性意义，且耳蜗毛细胞和螺旋神经节细胞均无明显缺失;经完整圆窗膜途径未见报告基因在耳蜗毛细胞和螺旋神经节细胞的表达。
　　结论:腺相关病毒不能通过完整圆窗膜;无论是耳蜗切开途径还是经胶原酶处理的圆窗膜途径，改良AAV载体携带的报告基因均可在耳蜗内外毛细胞及螺旋神经节细胞高效稳定地转染;较之耳蜗切开途径，经胶原酶处理的圆窗膜途径是一种更加安全、有效的基因转染途径。