HBV特异性细胞免疫与树突状细胞蛋白酶体功能相关性实验研究

摘要

乙型肝炎病毒(HBV)感染的过程中，HBV特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)是清除病毒的关键因素，而树突状细胞(Dendritic cells，DCs)作为专职抗原递呈细胞(Antigen presenting cells，APCs)，对CTL的诱导又起着决定性的作用；正常功能的DC对乙型肝炎患者的病情进展、血清转化乃至预后都有着重要影响。但是，在乙型肝炎尤其是慢乙肝患者，DCs数量和功能均呈下降趋势。DCs为何会发生数量减少和功能降低至今仍未完全阐明。近年来有相关文献报道了慢性病毒感染会减弱所在细胞的蛋白酶体功能，如HIV、HSV等(1，2)。受此启发，我们的实验对乙肝慢性化过程中HBV复制与DCs的蛋白酶体功能做了一系列的临床和基础研究，以期为打破慢乙肝患者体内免疫耐受、诱导有效细胞免疫提供新的思路。全文共分三章：
　　 第一章.慢乙肝患者DCs蛋白酶体功能分析
　　 1.目的
　　 优化人单核细胞源性树突状细胞(MoDCs)分离诱导方法，探讨慢乙肝患者体内树突状细胞蛋白酶体功能变化情况。
　　 2.材料和方法
　　 应用连续贴壁法及磁珠法分离培养人单核细胞源性树突状细胞(MoDC s)，诱导成熟后经流式细胞仪检测细胞表面标志(CD80，CD86，HLA-DR)，比较两种方法及不同诱导因素对DCs分化的影响。
　　 分离诱导慢乙肝患者的MoDCs，分析其蛋白酶体相关亚基表达及蛋白降解活性。
　　 3.结果
　　 流式细胞仪检测结果显示，两种分离方式诱导的MoDCs表面HLA-DR、CD83、CD86表达水平相差甚微；但磁珠分离法所得MoDCs纯度较高。以TNF-α和HBcAg分别诱导树突状细胞成熟，诱导后MoDCs的HLA-DR、CD83、CD86水平明显高于未加诱导剂组，但TNF-α和HBcAg诱导的组间差距不大。
　　 实验结果显示，相对于正常对照组，慢乙肝患者的MoDC免疫蛋白酶体亚基LMP2、LMP7表达率明显下降，且蛋白酶体功能出现下调；而蛋白酶体功能下降程度与患者ALT及HBV DNA水平无显著相关性。
　　 4.结论
　　 采用磁珠分离法可获得纯度较高的MoDCs，来源广泛，获取简单。所得DCs在体外培养的条件下可以稳定存在1w左右。流式细胞仪鉴定结果显示MoDCs表面特征分子表达明显，细胞状态较好，完全可以满足下游实验的需要。
　　 临床试验显示慢乙肝患者体内DCs蛋白酶体功能下调，免疫蛋白酶体亚基LMP2、LMP7合成受阻，提示DCs蛋白酶体功能异常可能与慢乙肝患者免疫耐受发生有关。
　　 第二章.HBV复制导致DC蛋白酶体功能下调的机制研究
　　 1.目的
　　 构建HBV全基因真核表达质粒pCDNA-HBV-EGFP，采用脂质体和电转染将质粒转入MoDCs并得以表达。观察HBV基因复制及相关蛋白合成对MoDCs蛋白酶体功能的影响。
　　 2.材料与方法
　　 扩增HBV全基因并将其克隆至带有报告基因EGFP的pCDNA3.1质粒中，构建能够表达HBV全基因的真核表达质粒pCDNA-HBV-EGFP，酶切鉴定。
　　 以磁珠法分离诱导MoDCs，诱导成熟后分别以脂质体法和微量电转法转染pCDNA-HBV-EGFP入MoDCs，观察HBV基因复制和病毒相关蛋白表达对MoDCs的蛋白酶体功能的影响。
　　 3.结果
　　 成功构建可以表达HBV全基因的真核表达质粒pCDNA-HBV-EGFP，双酶切鉴定显示质粒构建成功。运用脂质体及微量电转法两种方式转染改质粒入MoDCs，转染后RT-PCR、western blot、绿色荧光蛋白以及免疫荧光结果显示HBV在MoDCs内得到较高程度表达；而随着HBV基因复制和相关蛋白成分表达，MoDCs的蛋白酶体活性呈现下调趋势，表现为免疫蛋白酶体亚基LMP2、LMP7表达下降，同时MoDCs刺激同种异体T细胞增殖及细胞因子分泌能力也较对照组降低。
　　 4.结论
　　 所构建pCDNA-HBV-EGFP真核表达质粒转染入MoDCs可有效表达HBV相关蛋白，而HBV复制可下调MoDCs的蛋白酶体亚基生成，并抑制蛋白酶体的正常功能。
　　 第三章.蛋白酶体功能抑制对乙肝病毒复制的影响
　　 1.目的
　　 以不同剂量的蛋白酶体抑制剂MG132、Epoxomicin干预HepG2.2.15，以MTT法检测蛋白酶体抑制剂MG132和Epoxomicin对HepG2.2.15细胞的毒性。在此基础上选取合适剂量观察蛋白酶体抑制剂对HBV基因复制和蛋白表达的影响，探讨以蛋白酶体做为新的靶点抑制HBV复制的可行性。
　　 2.材料和方法
　　 优化HepG2.2.15细胞培养及传代条件，以不同剂量的蛋白酶体抑制剂MG132、Epoxomicin干预HepG2.2.15。得出IC50值，在此基础上以RT-PCR、westernblot、免疫荧光技术判断蛋白酶体抑制剂对HBV基因复制和蛋白表达的影响。
　　 3.结果
　　 MG132和Epoxomicin作用的HepG2-2.215细胞上清中HBV DNA、HBsAg和HBeAg均有明显下降，且对胞内HBcAg的生成也有一定的抑制作用；抑制程度随着蛋白酶体抑制剂浓度的增加而呈递增趋势，表现出较好的剂量依赖性和抑制效率。
　　 4.结论
　　 蛋白酶体抑制剂MG132、Epoxomicin可有效抑制HepG2.2.215细胞中HBV的基因复制及病毒抗原的表达；此外，蛋白酶体抑制剂对于HBcAg介导的核衣壳包装也有一定的抑制作用。