肿瘤坏死因子-α诱导生成内皮细胞微粒的蛋白质组学研究

摘要

目的：
　　 ①制作适合蛋白质组学研究的离体活化血管内皮细胞(vascular endothelial cell，VEC)模型;
　　 ②研究经肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)刺激后人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)蛋白质表达的变化与其生成的内皮细胞微粒(endothelial microparticle，EMP)蛋白质组成的关联;
　　 ③探讨EMP所转运的内皮细胞蛋白质在其与靶细胞相互作用过程中发挥的作用。
　　 内容：
　　 ①采用TNF-α激活HUVEC使其生成EMP，研究其量效和时效关系，制作离体的活化内皮细胞模型，并对EMP表型进行探讨;
　　 ②运用蛋白质组学技术分析TNF-α刺激前后HUVEC蛋白质表达差异;
　　 ③运用蛋白质组学技术检测TNF-α诱导生成的EMP蛋白质组成，通过与TNF-α刺激前后HUVEC差异蛋白的比较，寻找共同蛋白，分析这些蛋白质的功能，探讨内皮细胞活化过程中蛋白质转运机制及EMP的功能。
　　 方法：
　　 ①体外培养原代HUVEC，予以不同反应浓度和作用时间的TNF-α刺激，诱导其生成并释放EMP，同时以静息状态HUVEC作为正常对照。运用流式细胞术检测EMP数量及其表面CD62E、CD31表达情况，对数据进行统计学分析。
　　 ②运用蛋白质组学中的2-DE和MALDI-TOF/TOF-MS技术比较分析TNF-α刺激前后HUVEC蛋白质表达的改变，寻找差异蛋白。
　　 ③运用蛋白质组学中的LC-MS/MS技术检测鉴定TNF-α诱导生成的EMP蛋白质组成，将其与HUVEC差异蛋白进行比较，寻找共同蛋白。
　　 ④运用GO(gene ontology)和KEGG pathway对所发现的共同蛋白进行分析，获得其分布和功能等方面的信息。
　　 结果：
　　 ①100ng/ml TNF-α刺激HUVEC24h生成的EMP数量最多。反应浓度100ng/ml时TNF-α诱导产生的EMP数量与10ng/ml、200ng/ml的相比差异具有统计学意义(P＜0.05);作用时间24h时诱导产生的EMP数量与1h、3h的相比差异也具有统计学意义（P＜0.05）。
　　 ②反应24h时，TNF-α诱导产生的CD31+EMP数量及CD62E和CD31双阳性EMP数量与EMP总数的差异均有统计学意义（P＜0.05），而CD62E+EMP数量与EMP总数的差异没有统计学意义（P＞0.05）。
　　 ③2-DE技术显示TNF-α刺激前后HUVEC共有47个差异蛋白质点，使用MALDI-TOF/TOF-MS技术成功鉴定其中29个差异蛋白，包括8个蛋白质刺激后上调、12个刺激后下调、8个刺激后不再表达、1个刺激后新表达。
　　 ④LC-MS/MS技术显示TNF-α诱导产生的EMP包含83个蛋白质，与29个HUVEC差异蛋白比较后发现8个共同蛋白。在经TNF-α刺激HUVEC中，这8个蛋白质中1个表现为不再表达，4个表现为刺激后下调，3个表现为刺激后上调。
　　 ⑤8个共同蛋白中包含了HUVEC上调的差异蛋白中表达量差异最大者heat shock protein beta-1，以及下调的差异蛋白中表达量差异最大者annexin A2。
　　 ⑥8个共同蛋白在炎症反应、凝血反应、细胞凋亡、细胞增殖等方面具有重要作用。
　　 结论：
　　 ①TNF-α刺激HUVEC生成EMP的数量与TNF-α的反应浓度和作用时间有关，100ng/ml TNF-α刺激HUVEC24h可产生较多数量EMP，以此为依据可制作适合蛋白质组学研究的离体活化VEC模型。
　　 ②CD62E+可用于TNF-α诱导生成EMP的表型鉴定。
　　 ③HUVEC经TNF-α刺激后29个蛋白质发生了表达量或表达种类的改变，而其生成的EMP蛋白质组成与这些蛋白质表达的改变有直接关联。
　　 ④EMP不仅是反映内皮功能状态的标志物，而且是细胞间信息传递的介质。EMP在炎症反应、凝血反应、细胞凋亡、细胞增殖等方面与靶细胞相互作用过程中，其所转运的内皮细胞蛋白质可能发挥着重要作用。

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摘要

缩略语表

缩略语表(续)

绪论

第一部分 TNF-α刺激对HUVEC生成EMP的影响

引言

材料与方法

结果

讨论

第二部分 TNF-α刺激生成的EMP蛋白质组成及其转运的HUVEC蛋白质功能研究

引言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

附综述

致谢

攻读博士学位期间发表论文