钩端螺旋体病的实验室诊断及监测方法研究

摘要

钩端螺旋体病(简称钩体病)是由致病性钩端螺旋体(简称钩体)引起的世界范围内流行的人兽共患病,严重威胁着人类的健康和畜牧业的发展。钩体病的临床症状多变,动物宿主众多,实验室诊断和监测的研究工作任重而道远。
　　新发现的未知功能钩体外膜蛋白PL40特异且保守地存在于致病性钩体中,可与钩体病患者血清中的抗体特异性地结合。而LipL32是含量最丰富的钩体表面蛋白,被广泛应用于钩体病的相关检测中。因此本研究在非变性条件下原核克隆、表达和纯化了rPL40和rLipL32,并基于这两个重组蛋白建立间接ELISA的方法检测了116份钩体病疫区血清。以MAT作为金标准,rIApL32-ELISA和rPL40-ELISA的特异性分别为92％和90％,敏感性分别为56％和49％。Cohen's kappa系数分别为0.51和0.42。以上结果表明这两个重组蛋白可作为钩体病血清学检测的靶点,检测结果与MAT之间的一致性良好。此外,rPL40和rIApL32还有着一定的协同作用,如将两种蛋白的检测结果综合起来,可使敏感性和Cohen's kappa系数分别提高至72％和0.56。本研究还评估了商用诊断试剂盒SERION ELISA IgG,结果发现虽然该试剂盒的敏感性达80％,但特异性仅为69％,Cohen's kappa系数为0.47,并不如相关报道中的检测效果好。
　　钩体病的血清学检测具有依赖宿主免疫水平等局限性,因此本研究还开发了一种快速检测致病性钩体的侧向层析试纸。该试纸是基于一对rLipL32单克隆抗体(简称单抗)并结合胶体金技术研发的,其中的单抗对是从制备的29株能识别8个rLipL32抗原表位的单抗中两两配对筛选出来的。该试纸可用于钩体病的诊断和监控,检测rLipL32和钩体菌体的最小值分别为1 ng和104条。该方法填补了钩体病检测相关领域的空白。
　　与病原学检测相比,核酸检测敏感性更强,是钩体监测的重要手段。为了监测江西省钩体病常见宿主的带菌情况及评估PCR检测的效果,本研究在分析CDC历年资料的基础上,用以G1/(32、B64Ⅰ/B64Ⅱ和lipl32作为引物的PCR法检测了2009年10月在江西省采集的38份鼠肾,28份牛尿,50份猪肾和50份狗肾样本。检测结果表明,样本中野生鼠的钩体带菌率最高,是最主要的传染源,其次为狗,而猪和牛带菌率极低。虽然不同方法之间的一致性良好,但PCR的检出率明显高于分离培养。此外本研究还发现,引物G1/G2较,lipl32更适合用于鼠肾样本中钩体DNA的检测。而lipl32则在尿液的检测中有着更好的应用前景。