井冈霉素生物合成限速步骤解析及高产

摘要

井冈霉素作为抗水稻纹枯病的重要农用抗生素,在中国等亚洲国家被广泛使用,是我国的科研人员开发的具有自主知识产权的安全、高效、低价的抗真菌农药。由于其诸多优点,被迅速推广。目前我国对井冈霉素需求已经超过6万吨,年产值超4亿元。因此深入研究井冈霉素发酵过程及其产生菌的基因表达与代谢具有重要的经济价值和社会效益。
　　 在井冈霉素的发酵过程中,作为井冈霉素生物合成前体的有效氧胺有较大量的积累。这种积累对于工业生产井冈霉素的发酵过程而言,是不经济的。如果能够消除这种前体物的积累,将可能提高发酵终产物井冈霉素的产量。
　　 我们首先系统分析了有效氧胺积累的原因。造成有效氧胺积累的可能原因有两类:一是菌体将已经合成的井冈霉素再次分解生成有效氧胺,即在菌体中存在有效氧胺完全转化生成井冈霉素,再分解形成有效氧胺的过程(有效氧胺一井冈霉素一有效氧胺)。这可能是由于井冈霉素的β-糖苷键不稳定,在发酵过程中分解。针对于这种可能性,我们设计了将井冈霉素添加到发酵培养基中,在不接种的情况下在发酵温度(37℃)下连续培养一个发酵周期(5天),检测发现没有有效氧胺的生成,表明井冈霉素在发酵过程中是稳定的,不会被分解生成有效氧胺。这种积累也可能由于菌体在发酵过程中能够产生水解井冈霉素生成有效氧胺的β-糖苷酶。我们将井冈霉素分别添加到井冈霉素生物合成基因valA缺失突变株JXH1的胞外蛋白体系和cell-free体系中,同样也未检测到井冈霉素的分解和有效氧胺的产生,因此这种积累也不是由于菌体所产生的β-糖苷酶的酶解所造成的。
　　 有效氧胺积累的第二类可能原因是由于糖基化不完全造成的。糖基化过程受到糖基转移酶的催化活力和糖基供体的供给的影响。我们将糖基转移酶基因阳valG分别克隆到红霉素启动子PermE*井冈霉素生物合成基因valA的启动子PvalA的下游,并通过整合型载体pPM927将糖基转移酶基因valG在井冈霉素高产菌株中进行超量表达。转录分析表明valG基因在PvalA启动子的控制下,其转录水平在发酵前期(24小时)及发酵中期(48小时)提高到2.5倍以上,而在发酵后期(120小时),则仍保持在1.7倍以上。而在红霉素启动子PermE*啪控制下,valG的转录水平则始终保持在1.1-1.3倍。这表明使用此超量表达系统,糖基转移酶valG基因的转录水平有一定的提升。同时我们还发现在井冈霉素产生菌中,井冈霉素生物合成基因valA的启动子PvalA的作用优于红霉素启动子PermE*。对ValG的酶活验证表明,使用PvalA超量表达valG基因,糖基转移酶活力由234 pkat/毫克总蛋白提高到460 pkat/毫克总蛋白,酶活力提高了近一倍。但通过对井冈霉素的产量和井冈霉素与有效氧胺的比例的检测,我们发现超量表达糖基转移酶ValG没有能够减少有效氧胺的积累,同时井冈霉素的产量也没有明显的增加。证明糖基转移酶的酶活不足不是有效氧胺积累的原因。
　　 糖基化的过程,除了受到糖基转移酶活力的影响外,还与糖基供体的供给有关。因此我们进一步分析糖基供体UDP-葡萄糖的供给对于糖基化过程的影响。当我们添加UDP-葡萄糖至井冈霉素产生菌TL01小量发酵液中以及cel1-free体系中时,检测结果表明糖基化过程均被显著地加强。在含有大量UDP-葡萄糖存在的体系中,几乎未见有效氧胺的积累,此实验充分说明了井冈霉素产生菌中UDP-葡萄糖的供给不足可能是造成有效氧胺积累的原因。
　　 我们继而分析了井冈霉素产生菌中的UDP-葡萄糖的合成过程,并对参与UDP-葡萄糖合成过程的6-磷酸葡萄糖激酶(4779.Opkat/毫克总蛋白)、6-磷酸葡萄糖变位酶(1763.4pkat/毫克总蛋白)以及UDP-葡萄糖焦磷酸酶(26.4pkat/毫克总蛋白)之间酶催化活力进行了测定和比较。结果表明,相对于参与UDP-葡萄糖合成的其它酶的活力,UDP-葡萄糖焦磷酸酶的催化活力明显较低,其催化活力同时远低于次级代谢过程中的糖基转移酶的活力(234 pkat/毫克总蛋白)。通过以上实验,我们基本确定了井冈霉素产生菌中UDP-葡萄糖焦磷酸酶的活力不足是造成有效氧胺积累的主要原因。我们继而通过超量表达UDP-葡萄糖焦磷酸酶以提高菌体内UDP-葡萄糖的供给。
　　 我们在吸水链霉菌井冈变种5008中成功克隆到了UDP-葡萄糖焦磷酸酶合成基因(ugp),并对其体外催化活力进行了验证。将此基因克隆到PvalA启动子的下游,并通过整合型载体将ugp导入TL01中。对基因工程菌株的基因转录和体外酶活的测定表明ugp在转录水平上提高了2.5倍,而UDP-葡萄糖焦磷酸酶酶活力则从26.4pkat/毫克总蛋白提高到54.2pkat/毫克总蛋白,从而确定了ugp在TL01中的超量表达。进一步的产量检测显示通过超量表达UDP-葡萄糖焦磷酸酶,井冈霉素高产菌株TL01的产量从18克/升提高到了22克/升。并且井冈霉素与有效氧胺的比例(mol/mol)从3.15提高到了5.75,有效氧胺积累量显著下降。
　　 因此,我们通过系统分析和实验证明,通过超量表达UDP-葡萄糖焦磷酸酶的方式增加糖基供体UDP-葡萄糖的供给,能够显著地减少糖基配体有效氧胺的积累,并且能够有效的提高井冈霉素的产量。
　　 此外,我们还建立了井冈霉素高产菌株的高通量筛选方法。井冈霉素及其生物合成前体有效氧胺是海藻糖酶的抑制剂,其中有效氧胺的体外抑制活性是井冈霉素的100倍以上。我们通过体外添加抑制剂的方法,检测海藻糖酶水解生成葡萄糖反应的抑制程度,并利用在一定浓度范围内抑制剂浓度与生成葡萄糖浓度之间的线性关系,间接测量所添加的抑制剂的浓度。但由于有效氧胺和井冈霉素以一定的比例存在于发酵产物中,因此对于后续的高通量筛选而言,少量的有效氧胺所带来的抑制活性可能会超过大量的井冈霉素的抑制活性。因此,本实验采用突变井冈霉素生物合成基因簇中的糖基转移酶的策略,使得发酵产物中只存在有效氧胺。以高产菌株糖基转移酶突变菌株XZ2为出发菌株,通过全基因组转座子突变的方法,筛选显著影响有效氧胺产量的突变株。在研究过程中我们分别建立了利用颜色反应高通量的筛选突变株的方法、高通量的培养链霉菌的方法,同时优化了链霉菌体内转座系统。
　　 1.高通量的筛选有效氧胺突变株的方法
　　 对于高通量的筛选过程,我们利用了前述的有效氧胺在体外抑制海藻糖酶的原理。首先对水解反应体系进行了优化,通过100倍稀释微孔培养体系中有效氧胺的发酵提取液,使得海藻糖水解反应在加入一定浓度范围内(1-10 mg/L)的有效氧胺发酵提取液后,所生成的葡萄糖的浓度能够在20μg/ml至80μg/ml的浓度范围内。在此线性范围内,即可利用颜色的深浅来反映有效氧胺对于此水解反应的抑制程度。颜色越深,所生成的葡萄糖越多,反应体系中的有效氧胺的量越低。颜色越浅,所生成的葡萄糖越少,反应体系中的有效氧胺的量越高。此颜色反应可通过酶标仪进行高通量的检测。
　　 2.高通量的培养链霉菌的方法
　　 由于需要培养大量的突变株以验证其产量的差异,故传统的摇瓶发酵策略无法满足实验的需要。我们设计使用1ml深孔96孔板对大量的突变体进行固体培养发酵,有效地缩小了培养体系的体积。400μL的固体培养基添加至1mL的微孔中至培养结束后将培养基碾碎。添加400μL的无菌水至每个孔中作为提取液。将96孔板使用密封条密封后,置入超声波清洗器中超声提取30分钟。再置于37℃,220转摇床中提取6个小时。经此提取步骤后,有效氧胺的残留量低于首次提取量的5％。对微孔固体发酵的发酵曲线进行测定,最终确定了8天的培养周期。此培养体系具有良好的平行性和重复性,8株平行株的产量误差在5%以内,能够满足后续实验所需的高通量筛选的要求。
　　 3.链霉菌体内转座系统的优化。
　　 我们使用了能够在天蓝色链霉菌中高效转座的pTNM,此质粒上携带有Tn5转座系统以及温敏型复制子,能够通过提高培养温度使质粒丢失。但由于以温敏型复制子pSG5衍生的质粒在井冈霉素产生菌中以高温(超过42℃)培养依然难以完全丢失,因此我们构建了由pIJ101衍生的转座质粒。含有新转座质粒的井冈霉素产生菌在没有抗生素添加的情况下培养,质粒将会由于没有选择压力而完全丢失。通过硫链丝菌素的诱导并松弛培养,能够得到大量随机的插入突变体,转座发生的频率在103-104之间。对14株突变株的总DNA使用BamHI进行酶切处理,其中含有转座子元件的片段,通过酶联反应后能够形成具有特殊复制子的环形DNA。通过转化大肠杆菌并使用转座子元件内部的引物进行测序反应,能够对插入位点进行定位。使用此方法得到了14个不同的插入位点,表明插入位点具有很好的随机性。
　　 本研究共对836株有效氧胺的突变株进行了高通量的筛选,并对于此筛选体系进行了评估。其中有8株突变株,其有效氧胺的产量较出发菌株存在明显的变化(±＞20%)。其中2株有效氧胺的产量有提高,6株有效氧胺的产量有降低。本研究还对2株产量提高的菌株进行了回补实验,结果表明当携带有完整基因的质粒进入突变株体内后,2株突变株的产量回到了出发菌株的水平。