钙蛋白酶在阿霉素心脏毒性中的作用及其机制的研究

摘要

阿霉素是临床常用的抗肿瘤药物，但是阿霉素能够引起心脏毒性，并表现为心肌病。然而，阿霉素心脏毒性的机制尚不十分清楚，也没有行之有效的预防和治疗阿霉素心肌病的方法。钙蛋白酶属于钙离子依赖性的细胞内半胱氨酸蛋白酶家族，在心血管疾病中有重要作用。钙蛋白酶的活性被内源性抑制物calpastatin特异性地抑制。
　　目的：本研究应用特异性的内源性钙蛋白酶抑制物calpastatin过表达的转基因模型来集中研究钙蛋白酶在阿霉素诱导的新生小鼠心肌细胞、成年小鼠心肌细胞和在体小鼠心脏毒性中的作用及其具体机制。
　　方法：我们用酶消化的方法分离和培养新生和成年小鼠心肌细胞。钙蛋白酶活性用特异的钙蛋白酶底物来检测。心肌细胞的凋亡用caspase-3活性检测、DNA片段化酶联免疫吸附试验（ELISA）和Annexin-Ⅴ/碘化丙啶（PI）染色来衡量。活性氧产物（ROS）的产生用DCF-DA分子探针来检测。我们用阿霉素20mg/kg通过腹腔注射实验小鼠来制作阿霉素心脏毒性模型。心功能用无创性心脏超声和有创性血流动力学测量来评价。蛋白质印迹技术用来检测蛋白的表达。
　　结果：阿霉素显著降低培养的新生小鼠心肌细胞和在体小鼠心脏钙蛋白酶的活性。过表达内源性钙蛋白酶抑制物calpastatin或用药理性钙蛋白酶抑制剂增加阿霉素引起的新生和成年小鼠心肌细胞的凋亡和乳酸脱氢酶的释放。抑制钙蛋白酶也下调了阿霉素处理的心肌细胞总的蛋白激酶B（AKT）和磷酸化的蛋白激酶B（AKT，Thr308），并且同时也下调了糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β，Ser9）的磷酸化水平。抑制AKT进一步增加阿霉素引起的心脏损伤，这提示抑制钙蛋白酶的作用是通过失活AKT/GSK-3β信号通路来介导的。内源性钙蛋白酶抑制物calpastatin过表达降低了钙蛋白酶活性。在在体阿霉素引起的心脏毒性模型中，阿霉素注射5天后calpastatin过表达转基因模型的caspase-3活性和细胞质组蛋白相关的DNA片段进一步升高，并且经超声和血流动力学测定，calpastatin过表达转基因模型的心功能也更差。和阿霉素注射的野生型对照组相比，阿霉素注射的calpastatin过表达转基因小鼠的5天死亡率也更高。
　　结论：calpastatin过表达通过抑制钙蛋白酶对阿霉素诱导的心脏毒性起了更加有害的作用。因此，钙蛋白酶能够保护心肌细胞对抗阿霉素诱导的心脏毒性。

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前言

第一章 钙蛋白酶在阿霉素引起的培养心肌细胞毒性中的作用

实验一 阿霉素对新生小鼠心肌细胞钙蛋白酶（Calpain）活性的影响

实验二 药理性钙蛋白酶抑制剂对阿霉素引起的新生小鼠心肌细胞损伤的影响

实验三 内源性钙蛋白酶抑制物calpastatin过表达对阿霉素引起的新生小鼠心肌细胞损伤的影响

实验四 内源性钙蛋白酶抑制剂calpastatin过表达对阿霉素引起的成年小鼠心肌细胞损伤的影响

第二章 钙蛋白酶对在体阿霉素引起的心肌细胞毒性的作用

材料与方法

实验结果

第三章 钙蛋白酶对体外阿霉素引起的心肌细胞毒性中AKT信号通路的影响

材料与方法

实验结果

讨论

结论

参考文献

综述: 阿霉素心肌病的最新研究进展

致谢

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