天然反义转录本DHPS及其靶基因WDR83在胃癌中的表达调控及其意义

摘要

目的:胃癌发生中异常表达的癌基因和抑癌基因除受遗传学修饰外,还受表观遗传学调控。表观遗传修饰包括DNA甲基化、组蛋白修饰及调节性RNA介导基因调节。属于调节性RNA之一-天然反义转录本在真核生物基因组中广泛存在,在RNA干扰、选择剪接、X染色体失活、RNA编辑、生长发育等方面有重要作用。天然反义转录本是近五年来表观遗传学研究的新热点,遗憾的是,包括胃癌在内的许多肿瘤中天然反义转录本的表达调控情况还不明了,国内甚少学者涉足该领域。为了解胃癌发生中相关基因的天然反义转录本的表达情况,我们通过生物信息学网站及天然反义转录本数据库筛选与胃癌发生相关的天然反义转录本,并进一步探讨它们在胃癌发生发展中的表达调控机制及其意义。
　　方法:我们利用天然反义转录本数据库,结合组织的序列分析基因表达谱(serialanalysis of gene expression,SAGE)筛选出与胃癌发生密切相关的天然反义转录本,在胃癌组织中行以实时定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)及免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)技术检测天然反义转录本及靶基因的表达;在胃癌细胞中,我们用敲除(Knock down)及过表达(overexpression)天然反义转录本或靶基因方法来检测两者间的调节水平及发挥作用区域;用核糖核酸酶保护实验、2’-O-methyl oligoribonucleotides抑制实验、补救实验(rescue experiment)、α-amanitin干预实验、荧光素酶报告基因技术、qRT-PCR及western blot方法来探讨两者间调控机制。
　　结果:经过筛选初步实验的结果,天然反义转录本DHPS及靶基因WDR83(与细胞增殖调控密切相关)成为我们感兴趣的一对天然反义转录本。在胃癌组织中,DHPS与WDR83在mRNA和蛋白水平均表达上调,且呈明显正相关;在胃癌细胞系中,DHPS可以从RNA和蛋白两个水平正向调节靶基因WDR83表达,同时WDR83也可以从RNA和蛋白两个水平正向调节DHPS表达,DHPS与WDR83间存在着双向调控作用,且互补区3'UTR是发挥调控作用的主要区域;在胃癌细胞中,我们用核糖核酸酶保护实验(Rnase Protection Experiment)、α-毒蕈碱抑制实验及寡核苷酸抑制实验证实DHPS mRNA与wDR83 mRNA在3’UTR区形成RNA-RNA二聚体,并增强彼此mRNA稳定性;前体mRNA检测实验又提供了DHPS与WDR83的间调节主要发生在转录后水平;另外,DHPS和wDR83还可以上调胃癌细胞增殖力,可能与调控ERK活性及E2F1表达相关。
　　结论:我们的研究提示天然反义转录本DHPS及把基因WDR83通过影响胃癌细胞增殖力而在胃癌发生发展中起重要作用。在胃癌细胞中,DHPS与wDR83在mRNA和蛋白水平上存在双向正向调控,该双向调控主要和二者在互补区3’UTR形成RNA-RNA二聚体增强mRNA稳定性相关。上述发现丰富了胃癌的表观遗传学内容,并为胃癌发生发展机制和寻找胃癌预防乃至治疗新药物靶点提供新的思路和理论依据。