下呼吸道感染患者临床标本菌群特征的研究

摘要

下呼吸道感染是医学上常见的感染类型。在临床实践中,该感染对于病人的生存质量、疾病治愈率、病人死亡率等产生重要影响。同时,新近提出的“菌群协同病原(Community being pathogenic)”的概念将人们对于感染病原体的认识,特别是非疾病状态下有菌部位的感染提升到了一个新的高度。本论文的研究目的是以培养不依赖的分子生物学方法结合新一代的高通量焦磷酸测序技术(Pyrosequencing)为手段,以健康人、医院获得性肺炎(Hospital acquiredpneumonia,HAP)、社区获得性肺炎(Community acquired pneumonia,HAP)、原发性肺结核(Primary pulmonary tuberculosis,TB)病人的呼吸道分泌液、痰液、肺泡灌洗液为研究对象,对这些标本中的菌群全貌进行描述和对比研究,深入了解多病种下呼吸道菌群的变化情况。同时,运用菌群研究的方法寻找在感染中起到重要作用的细菌属(种),并对其致病性进行研究,验证通过菌群分析进行疾病分类及寻找病原体的可能性和合理性。
　　本课题共采集正常人呼吸道分泌物标本42例、HAP病人痰液标本101例、CAP病人痰液标本45例、TB病人肺泡灌洗液标本64例,通过标签引物(Barcoding primer)引导下的广范围PCR(Broad-range PCR)对标本中全部细菌的16s rKNA基因的V3高变区进行扩增,运用焦磷酸测序技术(Pyrosequencing)获得扩增序列信息。在本次研究中,共获得有效的V3区序列464,586条用于菌群分析。
　　在对于正常人、HAP病人和CAP病人的菌群整体描述和对比研究中发现,人体呼吸道菌群主要由五个菌门构成,它们分别是:厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、变形菌门(Proteobacteria)、梭杆菌门(Fusobacteria)和放线菌门(Actinobacteria)。在正常人和CAP病人中,厚壁菌门(Firmicutes)的序列占据绝对优势(正常人:41％、CAP:36％),而在HAP病人中却存在厚壁菌门和变形菌门两个优势菌门,其比例分别为43％和34％。在菌属水平,运用统计学非参数检验方法(Wilcoxon signed-rank test),对于正常人及CAP病人、CAP病人及HAP病人交叉共有的菌属序列数在总序列数中所占比例进行比较,发现在正常人和CAP病人共有的36个菌属中,有29个菌属的序列比例没有统计学差异(Asymp sig≥0.05);而在CAP与HAP病人共有的51个菌属中,有30个菌属的比例存在统计学差异(Asymp sig＜0.05)。运用Llnifrac的主坐标分析(Principal coordinates analysis,PCoA)结果显示,从整体上看,三类病人的菌群存在明显的差异。综合上述的结论,以上三类人群在各组人群内菌群差异较小而不同人群间的差异较大。相较HAP病人,CAP病人的菌群整体特征与正常人更为接近。
　　原发性肺结核是一种比较特殊的感染类型,本课题所采集的64份肺泡灌洗液标本来自于32位原发性肺结核病人(每位病人取结核病灶内及健康肺组织各1份)。通过对患侧和健侧的菌群比较分析发现,分枝杆菌科(Mycobacteriaceae)序列的检出率在两类标本中统计学上没有明显差异,PCoA结果显示健侧菌群和患侧菌群呈交叉分布,且分布比较分散,说明结核病人间菌群差异较大。在对于TB标本中所有检出的菌属进行定量分析后发现,贪铜菌属(Cupriavidus)取代了普通感染中的链球菌属(Streptococcus)成为了丰度最高的菌属,而此菌属在正常人、CAP和HAP病人中无法检出,由此构成TB病人菌群的一个特点。在对于健侧和患侧菌群的配对统计学分析(Paired Wilcoxon signed-rank test)中发现,在所有被检测出的142个菌属中,140个菌属的丰度在两侧肺组织内没有统计学差异,然而分枝杆菌属(Mycobacteria)和卟啉单胞菌属(Poohyromonas)却在结核病灶内的丰度明显增高。在TB病人菌科丰度的健侧和患侧的层次聚类热图(Hierarchical clustering heatmap)中显示,热网菌科(Pyrodictiaceae)和热变形菌科(Thermoproteaceae)的丰度极高,且两侧肺组织中没有显著差异,成为原发性肺结核病人菌群区别于其他病种菌群的另一特点。因此可以推断在此类人群中,分枝杆菌在病灶内及病灶外呈现广泛分布的态势,而患侧分枝杆菌属和卟啉单胞菌属的丰度明显增高很可能是结核结节形成的重要因素。另外,对比PCoA结果可以推断,相比CAP及HAP病人,肺结核病人的菌群整体更富多样性,但病灶内外菌群总体差异却不明显。贪铜菌属的高丰度表现提示其很可能是结核病人重要的继发性感染因素。
　　在进行CAP痰液标本的菌群研究中我们发现作为人体正常呼吸道菌群重要组成部分的罗氏菌属(Rothia)在此类人群中丰度明显高于正常人和HAP病人,虽然至今还没有关于罗氏菌属引起原发性肺部感染的报道,但是我们推测罗氏菌属很可能是CAP的重要感染因素之一。为此,我们通过罗氏菌属临床上最常分离的代表菌种——黏液罗氏菌(Rothia mucilaginosa)与非小细胞肺癌细胞H1975的相互作用进行致病性的研究。在细胞活性的检测试验(Cell counting kit-8,CCK-8)中发现,该细菌对细胞活性的抑制能力强于无致病性的对照大肠埃希菌(Escherichia coli,DH5α),但弱于具有致病性的肺炎链球菌(Streptococcuspneumonia);在Annexin V FITC/PI流式细胞仪检测细胞凋亡的实验中,该菌诱导细胞凋亡的能力依然介于致病性对照菌及非致病性对照菌之间。而在激光共聚焦显微镜(Laser confocal microscope)对细胞骨架微丝系统纤丝状肌动蛋白(F-action)的观察中发现该细菌对于微丝系统的破坏明显,可引起微丝断裂、解聚和蜷缩。通过以上实验可以发现黏液罗氏菌对于呼吸道来源的细胞具有明显的“致细胞病变”作用,而对于细胞固有结构的破坏在其致病性中扮演了重要的角色。
　　以高通量焦磷酸测序平台为基础的菌群研究技术使得对于呼吸道标本中各细菌组分的定量研究成为可能。通过研究我们发现,在普通的肺部感染中肺部菌群的特征与疾病分类有着密切的联系,因此通过菌群特征进行疾病分类是完全可能的,这对于现有的疾病分类方式是一种有效的补充。在原发性肺结核病人中,贪铜菌属的高丰度可以为TB病人继发感染的研究提供新的方向,而由于热网菌科和热变形菌科的大量存在或许可以将该菌群特征作为判定肺结核的一个新的依据。而对于黏液罗氏菌的“致细胞病变效应”则说明通过菌群定量分析寻找疾病病原体可能成为鉴定病原体的新思路。