阳离子脂质基因载体Lipid-mu peptide-DNA的研究

摘要

在过去的二十多年间，基因治疗已经在很多疾病治疗领域将研究从临床前推向了临床，这其中既有单基因疾病比如囊肿性纤维化和杜氏肌营养不良症的治疗，也包括更复杂的疾病比如癌症和心血管疾病的治疗。迄今为止最成功的案例当属重症联合免疫缺陷的基因治疗，不过在许多其他领域基因治疗的进展也非常引入瞩目。虽然在研究的推进过程中发现有的疾病（比如囊肿性纤维化）的基因治疗比预想要困难、见效要慢，使得工业界和学术界对这些疾病基因治疗的关注热度在过去十多年间有所下降，但是基因治疗对于不宜手术的和对传统疗法缺乏响应的疾病仍具有无可替代的优势，结合在多种疾病的临床治疗中取得的成绩，仍然表明了基因治疗是未来医学的希望之一。
　　 载体是基因治疗的重要组成部分，是影响治疗结果的重要因素。因为基因药物本身不能进入细胞，在体内环境中又极易被降解，因此起保护和携载作用的载体会直接影响到基因治疗的效果。纵观进入临床试验的基因药物多是选择使用病毒类基因载体，这是由于病毒类载体具有较高的基因输送效率。但是许多这类临床实验止步于Ⅰ期或Ⅱ期，很大程度上是因为病毒类载体的免疫原性和毒性较高。即使有些临床实验采用了ex vivo的策略，即在体外用病毒载体转染细胞，再将细胞通过手术途径植入病灶部位的方法避开人体免疫系统的攻击，病人仍然需要周期性的动手术取出老细胞植入新细胞，这不但增加了手术中感染的风险，也不利于病人接受。而非病毒类载体具有低毒性，低免疫原性，低致癌性的优点，大大提高了使用安全性。除此之外，非病毒类载体对携载基因的大小没有限制，可以重复给药，质量控制简单，制备可重复性高，这些优势都使得非病毒类载体成为未来最终实现基因治疗的可能方式。并且可用于系统给药的非病毒类载体，由于注射方式简单、便捷、微创，最终将成为治疗趋势发展的方向。
　　 非病毒类载体成功实现体内基因治疗的前提包括:首先，载体在循环系统中保持稳定以提高在病灶部位的基因药物浓度;其次，载体在靶细胞内及时高效地将基因药物释放到细胞质中以提高转染的效率。本论文按照这两个前提，首先采用高于传统修饰量的PEG脂质对基因载体Lipid-mu peptide-DNA(LMD)进行表面修饰，提高了载体在肿瘤部位的聚集程度;其次使用质子泵抑制剂类药物奥美拉唑抑制细胞中内涵体或溶酶体的酸化过程，提高了载体的体外和体内基因转染效率。具体内容和主要结果总结如下。
　　 和普通脂质DNA复合物的制备过程不同，LMD的制备是先将带负电的基因快速加入到带正电的多肽mu中，通过正负电荷相互作用形成带有负电的mu-DNA(MD)粒子，再将MD粒子加入到含有阳离子脂质的脂质体中，再次通过正负电荷相互作用形成净电荷为正电的LMD粒子。整个制备过程可以描述为mu，DNA和脂质体的自发组装，制备耗时短，利于重复。通过对粒径等物理化学性质和体外转染实验的优化，我们确定了LMD三种组分间的最佳比例DNA∶mu∶cationic lipid是1 mg∶0.6mg∶12μmol。在这个比例下得到MD粒径为102±12nm，zeta电位为-33±1 mV; LMD粒径为140±15nm，zeta电位为30±0.3 mV。之后我们使用原子力显微镜观察到LMD的形貌是球形或接近球形的粒子，大小比较均一。结合Miller教授实验室的冰冻蚀刻电镜图像，可知LMD具有MD粒子在核心，外面包裹脂质双层的结构。和传统脂质复合物相比，这种结构更加稳定，制备可重复性更高，并且可以在其表面修饰高于传统修饰量(10 mol％)的PEG脂质。
　　 由于PEG脂质头部的多羟基结构具有良好的亲水性，PEG聚合物长链又可以起到空间位阻的作用，故可以降低被修饰粒子和血液循环中蛋白间相互作用引起的调理作用，减少粒子和带负电蛋白之间聚集而形成大颗粒的程度，增加载体粒子在体内稳定性，延长循环时间，因此PEG修饰的载体也称为长循环载体。我们通过后期孵育法制备了可用于系统给药的长循环PEG-LMD。经过高于传统PEG修饰量(15-25 mol％)修饰的LMD的zeta电位由30 mV变成接近0，粒径则比修饰前略有增大，为170±30 nm。
　　 由于实体瘤的高通透性和滞留效应（Enhanced Permeability and Retention，EPR效应）长循环载体可以被动靶向到皮下移植瘤裸鼠的肿瘤部位。较高PEG表面修饰的LMD粒子可通过EPR效应更多地聚集在肿瘤部位，我们通过小动物活体成像、冰冻切片、免疫组化和实时PCR实验分别证实了此结论。使用近红外荧光染料Cy5.5标记LMD的脂质成分，我们使用小动物成像仪对一系列不同PEG表面密度的LMD粒子(0，10，15，23，25，30 mol％)在不同时间点于肿瘤处的分布进行了直观的观测:尾静脉注射后，荧光信号很快聚集在肿瘤部位，在较高PEG修饰密度下，比如15％-25％范围内，Cy5.5-PEG-LMD在肿瘤中有较强的荧光信号，在注射5天后，依然可以在肿瘤部位观察到明显的荧光信号，并且肿瘤部位的荧光强度持续高于其他组织。我们进一步从荧光图片上提取出相关组织和肿瘤的荧光强度，用组织面积和全身荧光总强度进行归一化处理，使用非房室模型对数据进行分析，得到了一致的结论。我们通过切片染色的方法用激光共聚焦显微镜观察分别标记了基因物质和脂质成分的LMD在肿瘤的分布，同样观察到含有23 mol％PEG的LMD比只有2 mol％或10 mol％PEG的LMD能够更多地分布在肿瘤部位。并且23％ PEG-LMD在不同制剂批次间和不同小鼠体内都表现出很强的瘤内荧光信号。最后我们通过实时PCR对不同PEG修饰密度的LMD在肿瘤部位的分布进行了定量分析，得到相同结论:不同PEG修饰密度的LMD肿瘤含量为25％＞23％＞15％＞30％＞10％。
　　 在优化PEG-LMD体内肿瘤分布后，我们接着考察了载体的基因转染能力。我们使用Luciferase质粒DNA作为报告基因，多轮体外和体内基因转染实验结果显示经过PEG修饰的LMD粒子无法进行有效转染。我们推测造成PEG-LMD转染效率低下的原因可能是PEG脂质阻碍了载体从内涵体中逃逸，随着内涵体pH值降低以及和溶酶体融合，载体粒子中的基因物质最终被酶解而丧失转染能力。为了增加载体从内涵体中逃逸的程度，我们首次将质子泵抑制剂类药物奥美拉唑和基因输送联合应用。基于质子泵抑制剂可以阻碍内涵体和溶酶体中pH值降低，我们假设这一特性可以增加载体粒子从内涵体逃逸的程度。实验证明有质子泵抑制剂存在下，移去荧光标记的23％ PEG-LMD6天后依然可以观察到细胞内的荧光，而没有质子泵抑制剂存在下的细胞观察不到明显荧光信号，并且荧光强度和质子泵抑制剂的浓度成正相关关系。体外转染实验表明0.1 mg/ml奥美拉唑可将23％ PEG-LMD的H1299细胞转染结果提高9倍。当使用碳链较短的PEG脂质DPPE-PEG时，0.1 mg/ml奥美拉唑可将23％PEG-LMD的H1299细胞转染结果提高34倍。体内转染实验中150 mg/kg奥美拉唑可将23％ PEG-LMD对H1299皮下移植瘤的转染效率提高3倍多。实验结果显示奥美拉唑可以通过抑制内涵体和溶酶体pH值降低，增加PEG化脂质载体LMD的体外和体内基因转染效率。

目录

声明

摘要

第一章 综述

1．1 基因治疗

1．1．1 概述

1．1．2 基因药物种类

1．1．3 基因导入的方法

1．1．4 基因治疗研究现状

1．2 以脂质体为基础的药物载体

1．2．1 脂质体概述

1．2．2 阳离子脂质体

1．2．3 脂质复合物转染的细胞机制和主要障碍

1．2．4 ABCD纳米粒子的概念

1．3 PEG修饰

1．3．1 PEG修饰脂质载体的必要性

1．3．2 PEG修饰带来的问题

1．3．3 解决PEG造成低水平内涵体逃逸问题的途径

1．4 研究目的与内容

第二章 LMD阳离子脂质复合物的制备和表征

2．1 引言

2．1．1 传统阳离子脂质复合物

2．1．2 LMD基因载体系统

2．2 材料与方法

2．2．1 材料与仪器

2．2．2 实验方法

2．3 实验结果

2．3．1 DNA/mu复合粒子MD的制备和表征

2．3．2 不同制备条件对MD粒径影响的研究

2．3．3 LMD脂质复合物纳米粒子的研究

2．3．4 PEG脂质修饰LMD的稳定性实验

2．3．5 不同脂质成分的LMD的原子力显微镜形貌观察

2．3．5 DSPE-PEG2000修饰LMD载体表面

2．4 分析与讨论

第三覃 高浓度PEG表面修饰增加基因载体肿瘤聚集

3．1 概述

3．1．1 Enhanced permeability and retention(EPR)效应

3．1．2 长循环脂质体

3．1．3 分子影像学

3．1．4 荧光染料的选择

3．1．5 小动物活体光学分子成像系统

3．1．6 免疫组化

3．2 材料与方法

3．2．1 材料与仪嚣

3．2．2 实验方法

3．3 实验结果

3．3．1 Cy5．5和Cy5．5-LMD体内外荧光分析

3．3．2 Cy5．5-LMD在负瘤裸鼠体内的分布和肿瘤处聚集

3．3．3 荧光信号的组织药代动力学分析

3．3．4 切片实验观察含有FAM-siRNA的LMD在肿瘤中分布

3．3．5 含有FAM-siRNA和Rhodamine脂质双标的LMD在肿瘤中分布

3．3．6 含有Rhodamine脂质的LMD在肿瘤中分布免疫组化实验

3．3．7 Real-time PCR定量肿瘤内LMD

3．4 分析与讨论

第四章 质子泵抑制剂提高PEG化载体基因输送效率

4．1 概述

4．1．1 PEG化对基因载体的重要性和局限性

4．1．2 质子泵的概念

4．1．3 质子泵抑制剂

4．1．4 质子泵抑制和基因治疗的结合应用治疗肿瘤

4．2 材料与方法

4．2．1 材料与仪器

4．2．2 实验方法

4．3 实验结果

4．3．1 不同N/P对细胞转染的影响

4．3．2 DNA剂量对细胞转染实验的影响

4．3．3 不同脂质组成的LMD对不同细胞系的转染

4．3．4 靶向细胞表面受体的LMD(tLMD)的细胞转染研究

4．3．5 氯喹对tLMD细胞转染的影响

4．3．6 奥美拉唑对LMD进入细胞影响的研究

4．3．7 奥美拉唑对细胞内输送siRNA的影响

4．3．8 奥美拉唑增加PEG化LMD的细胞基因转染效率

4．3．9 奥美拉唑对PEG化LMD体内分布影响的研究

4．3．10 奥美拉唑增加PEG化LMD体内基因转染效率

4．4 分析与讨论

第五章 全文总结

5．1 主要结论

5．2 研究展望

参考文献

致谢

攻读博士学位期间已发表或录用的论文