长春花萜类吲哚生物碱代谢调控和代谢组学的研究

摘要

作为药用和观赏植物，夹竹桃科的长春花（Catharanthus roseus(L.) G.Don）体内含有130多种具有生物活性的萜类吲哚生物碱（Terpenoid indole alkaloids,TIAs），其中应用最为广泛的是具有抗癌作用的双吲哚生物碱长春碱（Vinblastine）和长春新碱（Vincristine），以及它们的单吲哚前体物文多灵（Vindoline）和长春质碱（Catharanthine）。但是双吲哚生物碱在野生型长春花中的含量都很低，仅为植株干重的万分之一，而单吲哚生物碱含量也只在千分之一左右。TIAs本身复杂的化学结构局限了化学合成在工业生产上的应用。这些原因导致长春花药用成分的供需矛盾相当严重，使其价格极为昂贵。而 TIAs在长春花体内的代谢合成是一个分化水平较高且多步反应的繁复途径。因此，研究TIA在长春花中的代谢调控机制并阐明TIA代谢合成对长春花的生理意义，对提高长春花生物碱含量并获得高产、稳定的长春花生物碱药源是十分必要的。
　　本课题结合代谢工程和代谢组学等手段，从多方面研究TIAs在长春花植株体内的代谢合成及调控机制。利用代谢基因工程定向调控长春花体内的TIA合成途径并获得长春花重要生物碱高产的转基因株系，为解决长春花生物碱的供需矛盾提供一条新的途径。再结合以核磁共振为基础的代谢组学全面探讨 TIAs代谢合成对长春花植株生长发育的生理意义以及基因调控对长春花代谢网络的影响。此外通过对长春花植株进行喷洒处理，筛选能够诱导提高萜类吲哚生物碱含量的植物生长调节剂，并在转录和代谢水平上探讨其对生物碱合成的调控机理，为以后研究及生产应用提供依据。本论文取得主要结果如下：
　　1）对处于花期的长春花植株施加6种不同植物生长调节剂，采用高效液相色谱仪监测三种生物碱（文多灵、长春质碱和长春碱）的含量变化。结果表明茉莉酸甲酯对末花期中长春花体内的三种生物碱合成没有明显诱导作用。乙烯利能显著提高三种生物碱的含量，达到对照组的1.5倍。ABA和赤霉素3对长春质碱和长春碱的合成有一定的抑制作用。水杨酸对生物碱合成有微弱的诱导作用。而矮壮素在不同的浓度下，对生物碱的积累有不一样的影响：单吲哚生物碱含量会随着矮壮素浓度的升高而降低，双吲哚生物碱含量随着矮壮素浓度升高而升高。进一步研究分析表明，刚进入花期的长春花植株在茉莉酸甲酯单处理下，转录因子CrMYC2、ORCA3及其调控的TIA途径上关键酶等基因的表达量有明显上调，文多灵和长春质碱含量有所提高，但对长春碱的含量影响不大；乙烯利单处理能明显上调ORCA2、ZCT1、ZCT3、DAT和PRX1等基因表达量，并且文多灵、长春质碱和长春碱含量得到明显提高。茉莉酸甲酯和乙烯利的混合处理能增强单处理对文多灵和长春质碱合成的诱导作用。
　　2）采用根癌农杆菌介导的长春花遗传转化体系，将含转录因子ORCA3和关键酶G10H的单基因和双基因植物表达载体，转化入长春花下胚轴再生植株。经PCR和Southern blot验证获得了3株单转ORCA3的转基因长春花植株、5株共转ORCA3和G10H的转基因长春花植株；Real-time PCR分析结果表明ORCA3和G10H已在转基因长春花植株中过表达，并且受ORCA3调控的TIA途径上的其他关键酶基因（如ASα、TDC、STR、D4H等）的表达量也有提高；HPLC分析表明，转基因长春花中单吲哚生物碱文多灵和长春质碱含量都普遍显著提高，双吲哚生物碱脱水长春碱和长春碱含量只在部分转基因株系中提高。其中，单转ORCA3的转基因长春花植株中文多灵和长春质碱的平均含量分别是对照(非转基因植株)的2.59和2.29倍。共转ORCA3和G10H的转基因长春花植株中文多灵和长春质碱的平均含量分别是对照的2.98和2.14倍。
　　3）运用以核磁共振（Nuclear Magnetic Resonance,NMR）技术为核心的代谢组学，测定野生型长春花不同器官和不同年龄层叶片的代谢谱，研究长春花的整个初生和次生代谢网络，并结合多元统计分析法主成分分析（Principal component analysis，PCA）和偏最小二乘法判别分析（partial least-squares-discriminant analysis，PLS-DA）分析转基因和非转基因株系的代谢差异。结果显示不同器官的代谢组中所含的生物碱比例有显著差异，并且随着叶龄变化而改变。转基因和非转基因长春花的代谢差异主要集中在TIA合成途径，部分氨基酸、有机酸、糖类以及苯丙氨酸化合物含量也会发生变化，但是并不产生新的化合物。通过代谢工程增强 TIA的合成可能会对对其竞争支路苯丙氨酸途径也有一定影响,但是转基因不会使长春花植株体内产生新的不同于野生型的代谢物。

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第一章 文献综述

1.1植物次生代谢工程

1.2长春花萜类吲哚生物碱及其代谢合成概述

1.3长春花萜类吲哚生物碱合成的代谢调控和优化策略

1.4代谢组学对长春花的研究及核磁共振技术的应用

1.5本课题研究的目的和意义

第二章 植物生长调节剂对长春花萜类吲哚生物碱合成的调控与机制的研究

2.1引言

2.2材料与方法

2.3结果

2.4讨论

第三章 长春花ORCA3和G10H基因的遗传转化研究

3.1引言

3.2材料与试剂

3.3方法

3.4结果

3.5讨论

第四章 长春花代谢组学的研究

4.1引言

4.2材料、试剂与设备

4.3试验方法

4.4结果

4.5讨论

第五章 总结与展望

5.1研究结论

5.2本研究的主要创新点

5.3后续研究方向

参考文献

附录

致谢

攻读博士期间发表的论文和专利