转基因产品快速、高通量检测方法研究

摘要

随着转基因技术的广泛使用,转基因作物的种植面积和商业化应用逐年升高,而公众对于转基因生物安全性的争议和忧虑一直存在。为此,世界各国颁布了一系列法律法规强化转基因生物安全评价和标识管理制度。转基因产品检测技术和方法是转基因产品标识管理实施的核心技术依据,在转基因生物标识管理中发挥着重要作用。随着转基因作物及其产品规模化生产和商业化应用,转基因产品检测方法正向着快速、简便、高通量、自动化等方向发展。本文重点从快速和高通量两个方面开展转基因产品检测新技术和方法的探索研究。
　　1.基于简易 DNA提取装置和可视化等温扩增技术的转基因产品快速现场检测方法:基于气压法和硅胶膜吸附原理,设计了一套转基因产品基因组 DNA快速纯化装置,并集成优化的可视化 LAMP等温扩增技术,开发出一种现场、可视化转基因产品检测系统,用于实验室转基因产品常规检测和田间监测。
　　(1)该检测系统只需要1个小时左右就能完成从核酸提取到肉眼观察结果整个转基因产品检测过程:15分钟的核酸提取时间和40分钟的等温扩增时间。
　　(2)本文设计的转基因产品快速提取装置具有时间短、操作简便、无需离心机等大型实验设备等优点,纯化获得的DNA质量和商业试剂盒相当,得率较商业化试剂盒稍低。
　　(3)该检测系统具有非常高的灵敏度,较传统 PCR方法的灵敏度高出5-10倍,如转基因大豆MON89799和GTS40-3-2的检测灵敏度可以达到5个拷贝。
　　(4)利用该检测系统参与了美国农业部 GIPSA组织的转基因玉米和大豆能力水平测试,结果显示利用该系统获得的结果和定性、定量PCR检测结果一致,说明该系统可用于实际转基因产品检测。
　　(5)该检测系统不需要辅助设备,快速便捷的优点显示了其在田间检测应用中的潜力。我们选取了转基因水稻田间样本,分别针对CaMV35S启动子,NOS终止子和bar基因对田间样本进行分析,结果和预期相符合表明该方法可以很好的应用于转基因作物的田间检测。
　　2.基于疏水性芯片和寡核苷酸芯片的转基因产品高通量检测方法研究:
　　(1)本文根据植物基因组复杂和质量大的特点,设计了适合于植物基因组DNA扩增的疏水性芯片,用于芯片PCR扩增;
　　(2)分析全球已经商业化应用的转基因植物,筛选获得了120多个转基因转化体、构建、元件和内标准基因序列;
　　(3)针对上述序列分别设计了特异性芯片PCR引物和寡核苷酸杂交探针,通过实验筛选获得了包括41种转基因元件、48种转基因事件和8种内源基因片段在内的97个引物对和对应的97种探针,对所有转基因植物的覆盖率达到96.9％;
　　(4)通过优化和验证,点制获得了包含97个转基因靶序列的寡核苷酸探针芯片;
　　(5)集成疏水性芯片PCR和寡核苷酸探针芯片杂交技术体系,开发了一种高通量检测转基因产品检测方法,并用于实际转基因样品的分析。

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第一章 转基因产品检测方法研究进展

1.1全球转基因作物的商业化种植及安全管理

1.2转基因产品核酸检测方法

1.2.1转基因产品基因组DNA纯化

1.2.2核酸扩增技术

1.2.3核酸扩增产物分析方法

1.3展望

1.4 本课题研究的目的、内容和意义

第二章 基于简易DNA提取装置和可视化等温扩增技术的转基因产品快速现场检测方法

2.1实验材料、试剂与仪器

2.1.1实验材料

2.1.2 实验仪器

2.2 实验方法

2.2.1植物基因组DNA提取装置的设计

2.2.2用商业化的试剂盒提取植物基因组DNA的流程

2.2.3核酸浓度的测定和分析方法

2.2.4引物和探针的设计

2.2.5定性PCR的反应体系和条件

2.2.6定量PCR的反应体系和条件

2.2.7包裹荧光染料的胶囊制备

2.2.8改进后LAMP的反应体系

2.3 实验结果与讨论

2.3.1植物基因组DNA快速提取方法装置的设计

2.3.2对用该装置提取的植物基因组DNA进行评价

2.3.3改进后的LAMP方法检测

2.3.4整合了快速提取装置和改进后LAMP反应系统的灵敏度检测

2.3.5检测系统在GIPSA能力测试样品中的应用

2.3.6检测系统在转基因水稻田间检测中的应用

2.4小结与讨论

第三章 基于疏水性芯片和寡核苷酸芯片的转基因产品高通量检测方法

3.1实验材料、试剂与仪器

3.1.1实验材料

3.1.2 实验试剂

3.1.3 实验仪器

3.2 实验方法

3.2.1植物基因组DNA提取和纯化

3.2.2基因组DNA浓度测定和评价

3.2.3芯片的制作，疏水化处理及清洗

3.2.4引物的设计与点制

3.2.5探针的设计与点制

3.2.6两轮芯片PCR反应

3.2.7终产物检测

3.3 实验结果

3.3.1高通量疏水芯片和寡核苷酸芯片检测转基因产品的流程

3.3.2转基因靶标序列的甄选

3.3.3芯片PCR特异性引物的设计及验证

3.3.4寡核苷酸探针的设计和筛选

3.3.5高通量检测体系的建立和实际样品的设计

3.4小结与讨论

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间已发表或录用的论文