大豆黄酮合成酶基因的克隆与RNA干扰调控异黄酮含量的研究

摘要

类黄酮是植物生长过程中广泛存在的一类次生代谢产物，包括异黄酮、黄酮、查耳酮、花青素等具有生物活性的物质。它们对植物生长素运输、花色调节、植物-微生物之间的互作以及对人体健康有直接而复杂的影响。研究类黄酮功能及代谢途径的调控对明确植物的防御反应机制和提高食品的功能性成分具有重要的作用。
　　 在高等植物中，类黄酮是通过苯基丙酸类代谢途径合成的。目前，对苯基丙酸类代谢途径的研究已经进入了分子生物学领域，在大豆(Glycinemax)中，途径中越来越多的编码基因被克隆并鉴定。另一方面，代谢工程，特别是RNA干扰技术的发展，为研究调控植物次生代谢产物的积累及其在植物防御中的作用开辟了新的可能性。
　　 本研究根据其它物种中已报道的黄酮合成酶(FNSⅡ)基因序列及大豆基因组序列信息，进行生物信息学分析，在大豆栽培品种“合丰47”中通过反转录扩增，得到两个候选基因的cDNA序列，命名为GmFNSⅡ-1与GmFNSⅡ-2。根据序列分析GmFNSⅡ-1与已报道的一个大豆黄酮合成酶基因(CYP93B16)是同一基因，而GmFNSⅡ-2是一个全新的基因。对GmFNSⅡ-1与GmFNSⅡ-2的基因组序列、核苷酸序列、氨基酸序列、蛋白质的物理化学性质、蛋白质的高级结构及功能进行了生物信息学分析。
　　 通过在大肠杆菌（Escherichiacoli及裂殖酵母（Schizosaccharomycespombe）中融合蛋白的构建，对GmFNSⅡ-1与GmFNSⅡ-2进行酶活性分析。结果表明两个GmFNSⅡ蛋白都可以直接催化柚皮素(Naringenin)转化为大豆黄酮(Apigenin)。两个GmFNSⅡ基因的组织特异性表达情况相似，在检测的6个组织中都有表达，但总的来说，在根和未成熟种子中的表达量较低。特别的是，在受到渗透胁迫时，幼苗的根、茎及叶中，两个GmFNSⅡ基因的表达量都显著提高，表明这两个基因在大豆的胁迫信号传导过程中有重要作用。
　　 本研究中，根据RNA干扰技术原理，以P1304+PBⅡ21载体为基本骨架，构建了GmFNSⅡ基因的RNA干扰植物表达载体P1304+-GmFNSⅡ-RNAi;以pCAMBIA3300载体为基本骨架，构建了GmFNSⅡ基因与黄烷酮3-羟化酶基因(F3H)双价的RNA干扰植物表达载体p3300-GmFNSⅡi-F3Hi，并分别构建了两基因的单价RNA干扰植物表达载体p3300-GmFNSⅡi与p3300-F3Hi。
　　 通过发根农杆菌（Agrobacteriumrhizogenes）ATCC15834对大豆子叶节的转化，验证所构建RNA干扰植物表达载体的效率。结果发现，P1304+-GmFNSⅡ-RNAi载体转化的毛状根中，GmFNSⅡ-1与GmFNSⅡ-2基因的表达都受到的显著抑制(＜10％)，特别是GmFNSⅡ-2基因(＜5％)。在p3300-GmFNSⅡi、p3300-F3Hi及p3300-GmFNSⅡi-F3Hi载体转化的毛状根中，GmFNSⅡ或/与F3H基因的表达受到显著抑制，表达量与对照相比降低90％以上。同时，HPLC分析结果显示，RNAi载体转化生成的毛状根中，黄酮的含量与异黄酮总含量发生了明显变化。其中双价RNAi载体对总异黄酮含量的增长具有更好的效果，转化根中总异黄酮含量是对照的两倍。研究结果为利用分子生物学方法，特别是RNAi技术提高大豆异黄酮含量提供了研究基础，并为其他相似的植物次生代谢产物的调控积累提供了依据。
　　 本研究中，我们检测了体外条件下，不同浓度的大豆黄酮(Apigenin)与染料木素(Genistein)对导致大豆7种主要真菌病害的病原菌生长速度的影响，这7种病原菌包括:Colletotrichumtruncatum,Macrophominaphaseolina,Phomaexigua,Phytophthorasojae,Pythiumultimum,Rhizoctoniasolani与Sclerotiniasclerotiorum。结果发现，两种类黄酮对实验中的所有病原菌生长都有抑制作用，但抑制效果不同，如:相对其它病原菌，C.truncatum受到的抑制更小而P.exigua受到的抑制更大。并且随着两种类黄酮浓度的提高，抑制效果有明显的剂量效应，但在低浓度下，染料木素表现出更好的抑制作用。研究结果提示我们，在通过代谢工程增强大豆抗病性的研究时，染料木素可能更适宜于作为基因工程的改良的目标。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 植物的次生代谢

1．2 类黄酮的研究

1．2．1 类黄酮的结构与分布

1．2．2 类黄酮的功能

1．3 大豆异黄酮的研究

1．3．1 大豆异黄酮的结构

1．3．2 大豆异黄酮的功能

1．4 大豆类黄酮的生物合成途径

1．4．1 苯基丙酸类(Phenylpropanoid)代谢途径简介

1．4．2 黄酮合成酶研究进展

1．4．3 异黄酮合成酶的研究进展

1．4．4 黄烷酮3-羟化酶的研究

1．4．5 其他关键酶的研究

1．5 代谢工程在植物中的应用

1．5．1 代谢工程简介

1．5．2 加速限速反应

1．5．3 转录调控因子策略

1．5．4 改变代谢途径流向

1．6 RNAi的研究进展

1．6．1 RNAi的发现

1．6．2 RNAi的原理

1．6．3 RNAi在植物代谢工程中的应用

1．6．4 RNAi植物表达载体的构建

1．7 大豆遗传转化方法

1．7．1 农杆菌介导法

1．7．2 基因枪法

1．7．3 花粉管通道法

1．8 毛状根的研究进展与应用

1．8．1 Ri质粒

1．8．2 发根农杆菌转化机制

1．8．3 发根农杆菌的植物转化方法

1．8．4 毛状根的应用

1．9 大豆病害的研究进展

1．9．1 大豆主要病害简介

1．9．2 次生代谢物质的抗病机制

第二章 本课题研究的内容和意义

2．1 本课题研究的内容

2．2 本课题研究的意义

第三章 大豆黄酮合成酶基因的克隆与功能鉴定

3．1 材料和试剂

3．1．1 植物材料

3．1．2 质粒和菌种

3．1．3 实验试剂

3．1．4 培养基和溶液配方

3．1．5 PCR扩增所用引物列表

3．2 实验方法

3．2．1 植物总RNA的提取(TRIzol法)及检测

3．2．2 第一链cDNA的合成

3．2．3 GmFNSⅡcDNA全长片段的克隆

3．2．4 目的片段的电泳回收

3．2．5 载体与目的DNA片断的连接

3．2．6 大肠杆菌感受态细胞的制备与转化

3．2．7 质粒DNA的提取

3．2．8 生物信息学分析

3．2．9 GmFNSⅡ蛋白的原核表达分析

3．2．10 体外酵母表达分析酶的活性

3．2．11 亚细胞定位

3．2．12 Real Time RT-PCR反应

3．3 实验结果与分析

3．3．1 两个候选GmFNSⅡ基因cDNA的克隆

3．3．2 两个候选GmFNSⅡ基因的生物信息学分析

3．3．3 两个候选GmFNSⅡ基因在原核细胞中的表达

3．3．4 酵母表达验证候选基因具有黄酮合成酶活性

3．3．5 GmFNSⅡ-1与GmFNSⅡ-2的亚细胞定位

3．3．6 GmFNSⅡ-1与GmFNSⅡ-2的组织特异性表达

3．4 讨论

3．4．1 GmFNSⅡ的克隆

3．4．1 GmFNSⅡ的功能

第四章 RNA干扰型植物表达载体的构建

4．1 材料与试剂

4．1．1 植物材料

4．1．2 质粒和菌种

4．1．3 实验试剂

4．1．4 培养基和溶液配方

4．1．5 PCR扩增所用引物列表

4．2 实验方法

4．2．1 植物总RNA的提取(TRIzol法)及检测

4．2．2 第一链cDNA的合成

4．2．3 目的基因cDNA全长的克隆

4．2．4 目的片段的电泳回收

4．2．5 载体和目的DNA片断的连接

4．2．6 大肠杆菌感受态细胞的制备与转化

4．2．7 质粒DNA的提取

4．2．8 GmFNSⅡ RNAi植物表达载体的构建

4．2．9 F3H RNAi植物表达载体的构建

4．2．10 p3300--GmFNSIIi-F3Hi的构建

4．3 实验结果与分析

4．3．1 目的基因的克隆

4．3．2 干扰片段的克隆

4．3．3 pHANNIBAL-gene-RNAi的构建

4．3．4 P1304+-GmFNSⅡ-RNAi载体的构建

4．3．5 p3300-GmFNSⅡi与p3300-F3Hi载体的构建

4．3．6 p3300-GmFNSⅡi-F3Hi的构建

4．3．7 载体构建流程图

4．4 讨论

4．4．1 植物中RNAi的作用过程

4．4．2 植物中RNA干扰表达载体的构建

第五章 发根农杆菌介导的大豆转化

5．1 材料与方法

5．1．1 植物材料

5．1．2 质粒和菌种

5．1．3 实验试剂

5．1．4 培养基和溶液配方

5．1．5 PCR扩增所用引物列表

5．2 实验方法

5．2．1 植物表达载体导入农杆菌

5．2．2 发根农杆菌诱导大豆毛状根的生成

5．2．3 植物基因组DNA提取

5．2．4 毛状根PCR检测

5．2．5 Gus基因的组织化学检测

5．2．6 植物总RNA的提取(TRIzol法)及检测

5．2．7 第一链cDNA的合成

5．2．8 定量PCR分析

5．2．9 HPLC测定毛状根中类黄酮含量

5．2．9 转基因植株的Southern杂交

5．3 实验结果与分析

5．3．1 RNAi植物表达载体导入农杆菌

5．3．2 毛状根的生成情况分析

5．3．3 毛状根的PCR检测

5．3．4 毛状根的GUS组织化学检测

5．3．5 转基因毛状根的Southern blotting分析

5．3．6 RNAi载体上基因表达的变化

5．3．7 HPLC分析毛状根中类黄酮的含量变化

5．4 讨论

5．4．1 发根农杆菌介导的植物转化

5．4．2 大豆类黄酮代谢的基因调控

第六章 类黄酮对大豆病原菌生长的影响

6．1 材料和试剂

6．1．1 病原菌菌种

6．1．2 试剂

6．1．3 培养基

6．2 实验方法

6．2．1 病原菌的预培养

6．2．2 病原菌生长面积测量

6．2．3 数据处理

6．3 实验结果

6．3．1 病原菌生长速度

6．3．2 第一组实验结果分析

6．3．3 第二组实验结果分析

6．4 讨论

第七章 本研究的创新点与今后工作展望

7．1 研究的主要结论

7．2 研究的创新之处

7．3 研究中发现的问题

7．4 今后工作展望

附录 符号说明

参考文献

致谢

博士期间发表的论文和专利