血管平滑肌细胞与内皮细胞相互交流的力学生物学机制

摘要

血管重建(remodeling)是心血管疾病共同的发病基础和基本的病理过程，力学因素在其中起重要调控作用。血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)与血管内皮细胞(endothelial cells，ECs)在结构上相邻，功能上有密切联系，它们之间的相互交流(cross-talk)在血管生理功能的维持和血管重建中均扮演着重要的角色。然而，在力学因素作用下，ECs与VSMCs相互交流的力学生物学(mechanobiology)机制尚需进一步阐明。
　　 本文基于本实验室前期取得的低切应力(low shear stress，LowSS)诱导下血管差异蛋白质组学数据，以ECs与VSMCs相互交流在应力诱导血管重建中的作用为着眼点，开展了两部分研究:
　　 首先，依据生物信息学分析所预测的蛋白质相互作用网络，应用ECs与VSMCs联合培养的平行平板流动腔系统对ECs分别施加正常切应力(normal shear stress，NSS)和LowSS，研究预测网络中提示的分泌型蛋白PDGF-BB和TGF-β1及其相关蛋白LaminA、LOX和磷酸化ERK1/2在ECs和VSMCs相互交流中的作用及其机制。结果显示，LowSS诱导ECs和VSMCs的PDGF-BB和TGF-β1分泌，LaminA表达降低，LOX和磷酸化ERK1/2表达增高，细胞增殖和迁移能力增强。用PDGF-BB和TGF-β1重组蛋白对静态培养下的ECs和VSMCs进行刺激也得到了类似结果。干扰ECs的PDGF-BB表达，发现LowSS所诱导的ECs和VSMCs的LaminA、LOX和磷酸化ERK1/2蛋白表达、细胞增殖和迁移被抑制;而干扰ECs的TGF-β1的表达，则对LowSS所诱导的VSMCs的上述变化无影响;应用中性抗体分别封闭VSMCs的PDGF-BB和TGF-β1的作用，则抑制了LowSS所诱导的ECs的上述变化。结果表明，PDGF-BB和TGF-β1在LowSS诱导的ECs和VSMCs相互交流中发挥不同作用，ECs通过分泌PDGF-BB调节VSMCs的功能，而VSMCs则通过分泌PDGF-BB和TGF-β1正反馈调节ECs的功能。
　　 然后，本文根据血管差异蛋白质组学结果的提示，选择在血管组织中表达，但功能未知的力学敏感分子—Rab28，深入研究了高张应变条件下VSMCs与ECs相互交流对其表达的影响及其机制。应用大鼠高血压模型和细胞张应变加载系统模拟血管细胞在高血压状态所承受的周期性张应变，探讨了Rab28在血管细胞中的功能及调控机制。结果显示，高血压大鼠颈总动脉的Rab28表达增高;高张应变诱导了VSMCs的Rab28表达;张应变加载后，用VSMCs的培养基培养静态ECs后，ECs的Rab28表达也增高。对VSMCs的培养基进行检测发现，高张应变可促进VSMCs自分泌血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)。AngⅡ既作用于VSMCs自身，又通过旁分泌作用于相邻的ECs，上调ECs和VSMCs的Rab28表达。干扰ECs的Rab28表达抑制ECs增殖，诱导其凋亡和迁移;干扰VSMCs的Rab28表达则抑制VSMCs迁移。在ECs中，Rab28和NF-κB存在细胞内共定位。ECs处于饥饿状态时，NF-κB和Rab28主要分布在胞浆;ECs受AngⅡ刺激后，NF-κB和Rab28则主要分布在胞核。干扰ECs的Rab28表达，NF-κBp65亚基磷酸化水平下降，入核减少;抑制NF-κB活化，则造成Rab28表达下降。结果提示，NF-κB活化机制中，Rab28可能参与了NF-κB的入核过程;反之，NF-κB活化后上调Rab28的表达。NF-κB活化入核与Rab28表达之间存在反馈调控。
　　 综上所述，在LowSS条件下，ECs通过PDGF-BB调控VSMCs的功能，而VSMCs则通过PDGF-BB和TGF-β1对ECs的功能进行反馈调节;在高张应变条件下，VSMCs通过Ang-Ⅱ调控ECs的Rab28表达，Rab28可能参与了NF-κB的活化入核，进而调控ECs的功能。这些结果对阐明血管重建的力学生物学机制有重要意义，也为心血管疾病的基础和临床研究提供了新的力学生物学思路。

目录

声明

摘要

英文缩略语

第1章 绪论

1．1 力学因素与血管重建

1．1．1 低切应力与血管重建

1．1．2 张应变与血管重建

1．2 血管重建中内皮细胞与平滑肌细胞的相互交流

1．3 低切应力诱导血管重建的蛋白质组学和信号转导网络预测

1．3．1 低切应力条件下体外培养血管的蛋白质表达谱差异

1．3．2 本文的主要研究思路

第2章 低切应力条件下PDGF-BB和TGF-β1在血管平滑肌细胞和内皮细胞相互交流中的作用及其机制

2．1 引言

2．2 实验仪器与材料

2．2．1 主要的溶剂溶液成分及配制

2．2．2 实验动物及实验材料

2．2．3 实验仪器

2．3 实验方法

2．3．1 大鼠胸主动脉ECs和VsMCs原代培养、传代培养和鉴定

2．3．2 内皮细胞和血管平滑肌细胞联合培养和平行平板流动腔系统

2．3．3 细胞迁移检测(Transwell法)

2．3．4 细胞增殖检测(BrdU掺入比色法)

2．3．5 重组蛋白刺激和中和抗体封闭实验

2．3．6 siRNA干扰

2．3．7 蛋白免疫印迹(Western blotting)

2．3．8 RT-PCR

2．3．9 酶联免疫吸附实验(ELISA)

2．3．10 统计学分析

2．4 结果

2．4．1 低切应力条件下联合培养细胞PDGF-BB、TGF-β1、LaminA、LOX和磷酸化ERK1／2表达的变化

2．4．2 低切应力条件下细胞迁移和增殖的变化

2．4．3 重组PDGF-BB和TGF-β1对细胞Lamin A，LOX，磷酸化ERK1／2表达及迁移、增殖的影响

2．4．4 siRNA干扰对细胞PDGF-BB、TGF-βB、Lamin A、LOX和磷酸化ERK1／2表达以及细胞迁移和增殖的影响

2．4．5 联合培养VSMCs通过PDGF-BB和TGF-β1正反馈调控低切应力诱导的ECs迁移和增殖

2．5 讨论

第3章 高张应变条件下血管平滑肌细胞与内皮细胞相互交流对细胞Rab28表达的影响及其机制

3．1 引言

3．2 实验仪器与材料

3．2．1 主要的试剂溶液成分及配制

3．2．2 实验动物和抗体

3．2．3 实验仪器

3．2．4 引物和小RNA

3．3 实验方法

3．3．1 高血压大鼠模型的建立

3．3．2 大鼠颈总动脉取材、原位增殖与凋亡测定、Western blotting

3．3．3 大鼠胸主动脉ECs和VSMCs原代培养、传代培养和鉴定

3．3．4 血管细胞的周期性张应变加载

3．3．5 细胞增殖、凋亡和迁移检测、Western blotting

3．3．6 条件培养基的制备和使用

3．3．7 小RNA干扰

3．3．8 细胞内囊泡染色

3．3．9 免疫细胞化学染色

3．3．10 新生RNA标记

3．3．11 免疫共沉淀

3．3．12 统计学分析

3．4 结果

3．4．1 高血压大鼠血管组织的Rab28表达及血管细胞的增殖与凋亡

3．4．2 高张应变条件下ECs和VSMCs的Rab28表达

3．4．3 VSMCs与ECs相互交流对细胞Rab28表达的影响

3．4．4 VSMCs条件培养液中血管紧张素Ⅱ的检测和外源性Ang-Ⅱ上调ECs的Rab28表达

3．4．5 siRNA干扰ECs的Rab28抑制增殖，诱导其凋亡和迁移；抑制VSMCs迁移

3．4．6 Rab28在ECs中的定位与分布

3．4．7 Rab28与NF-κB活化的关系

3．4．8 Rab28与NF-κB免疫共沉淀

3．5 讨论

全文小结

文献综述

参考文献

致谢

攻读博士学位期间已发表的学术论文