白细胞炎性迁移抑制剂活体筛选及其分子机制研究

摘要

免疫细胞的炎性迁移参与了许多人类的免疫相关疾病的进展过程，因此寻找抑制免疫细胞炎性迁移的小分子药物以及研究其调控机制对于免疫相关疾病的治疗具有重要的意义。转基因斑马鱼系
　　TG:(zlyz-GFP)以绿色荧光蛋白特异性标记斑马鱼体内的白细胞，在转基因斑马鱼胚胎尾部靠近末梢循环处切一个伤口后的六小时之内，可以观察到一定数目的荧光阳性细胞在伤口处的聚集。此活体炎性迁移模型由于可视且可量化，非常适合用于炎性细胞迁移的机制探寻以及小分子药物筛选等。大麻碱Ⅱ型受体CB2或Cnr2（cnr2）对于免疫细胞迁移的调控作用已被广泛研究，但其调控机制尚不明确。我们利用转基因斑马鱼系TG:(zlyz-GFP)进行了一次大规模的小分子化合物筛选，从中筛选得到大麻碱受体激动剂与5-磷脂合酶（5-LO或alox5）抑制剂均能有效抑制斑马鱼白细胞的炎性迁移。并且筛选得到的小分子均能有效抑制人THP-1细胞系的体外趋化性迁移。我们还利用锌指合酶技术建立了cnr2基因突变的斑马鱼系。cnr2突变的斑马鱼胚胎中白细胞的炎性迁移显著增加，而敲低Alox5表达后巨噬细胞的炎性迁移被明显抑制。进一步的机制研究结果表明，Cnr2与Alox5具有通路上的相关性，并且alox5的转录直接受转录因子c-Jun调控。Cnr2受体受其激动剂激动后抑制JNK/c-Jun的磷酸酶活性从而抑制alox5基因的表达。因此我们的研究结果表明Cnr2通过JNK通路调控alox5基因的表达，从而调控白细胞的炎性迁移。而Cnr2激动剂与Alox5抑制剂合用时抗炎的协同作用对于临床上治疗免疫相关疾病具有一定的指导意义。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 细胞迁移简介

1．2 白细胞炎性迁移的生理与病理意义

1．3 斑马鱼背景知识介绍

1．4 利用斑马鱼进行小分子化合物筛选的优势，现状及前景

1．5 斑马鱼的免疫系统与人类高度保守

1．6 大麻碱系统在免疫反应与细胞迁移中的作用

1．7 白三烯通路在炎症反应与细胞迁移中的作用

1．8 MAPK通路在急性炎症反应过程中的作用

1．9 斑马鱼的造血系统与哺乳动物高度保守

第二章 材料与方法

2．1 实验用鱼及喂养

2．2 对斑马鱼胚胎尾部切割进行损伤

2．3 THP-1细胞培养

2．4 THP-1细胞系体外趋化性迁移实验

2．5 小分子药物

2．6 morpholino反义寡核苷酸及显微注射

2．7 流式细胞术分选绿色荧光阳性的细胞

2．8 实时荧光定量PCR

2．8．1 RNA抽提

2．8．2 逆转录

2．8．3 实时荧光定量PCR

2．9 Western blot蛋白免疫印迹法

2．9．1 细胞蛋白样品收集

2．9．2 斑马鱼去卵黄囊以及蛋白样品制备

2．9．3 电泳，转膜及显色

2．10 锌指合酶技术敲除斑马鱼cnr2基因

2．11 siRNA与细胞转染

2．12 mRNA合成

2．13 全胚胎染色质免疫共沉淀(E-ChIP)

2．14 持续激活型JNK质粒构建

2．15 苏丹黑染色

第三章 利用转基因斑马鱼筛选抑制巨噬细胞迁移的小分子药物

3．1 前言

3．2 结果

3．2．1 在96孔板中利用转基因斑马鱼胚胎进行小分子药物筛选

3．2．2 增加浓度梯度重复筛选结果

3．2．3 筛选结果在人单核细胞系的趋化性迁移中保守

3．3 讨论

第四章 大麻碱Ⅱ受体在斑马鱼白细胞炎性迁移过程中的作用

4．1 前言

4．2 结果

4．2．1 WIN通过Cnr2抑制斑马鱼胚胎白细胞的炎性迁移

4．2．2 敲低或敲除cnr2基因的表达能够引起白细胞炎性迁移的增加

4．2．3 Cnr2对于白细胞炎性迁移的调控作用同样在人类细胞系中保守

4．3 讨论

第五章 Alox5在白细胞炎性迁移过程中的作用以及Cnr2与Alox5之间的通路相关性

5．1 前言

5．2 结果

5．2．1 Alox5能够调节白细胞的炎性迁移

5．2．2 白细胞炎性迁移过程中Cnr2通过调控Alox5表达调节细胞迁移

5．2．3 Cnr2激动剂与Alox5抑制剂在抑制急性炎症中具有协同效果

5．3 讨论

第六章 Cnr2通过JNK通路调控Alox5表达

6．1 前言

6．2 结果

6．2．1 Cnr2通过JNK通路调节白细胞炎性迁移

6．2．2 Cnr2通过JNK通路直接调节Alox5的转录激活

6．3 讨论

第七章 大麻碱Ⅱ型受体在斑马鱼髓系造血中的作用

7．1 前言

7．2 结果

7．3 讨论

第八章 结论与展望

参考文献

已发表与待发表文章列表

致谢