热休克蛋白90在肝硬化门静脉高压症内脏高动力循环中的作用

摘要

我国是病毒性肝炎的高发地区，而乙型病毒性肝炎慢性化引起肝硬化，并最终导致门静脉高压症（portal hypertension，PHT）的患者人群数量庞大。肝硬化门静脉高压症是严重威胁人类健康的一种临床综合征，其内脏高动力循环相关的并发症是临床上常见而且棘手的难题，其中以食管胃底静脉曲张破裂导致大出血最为严重，是导致PHT患者死亡的重要原因之一，也是临床上治疗的重点。因此，阐明PHT发生发展的病理生理机制，以期寻求合适的治疗策略，防治食管胃底静脉曲张破裂出血，改善PHT患者的生活质量，降低死亡率，仍然具有重要的社会意义。肝硬化门静脉高压症以肝内血流阻力增加和内脏及全身高血流动力循环为主要发病机制，其中前者被认为是PHT发生的起始因素，而后者在PHT的维持和发展过程中具有不可替代的作用。
　　目前研究已经证实，肝硬化导致PHT发生之后，内脏血管是扩张的，而血液循环中缩血管物质如去甲肾上腺素（nore pinephrine，NE）等浓度却增加，即表现为内脏动脉对缩血管物质低反应性。而大量研究同时也发现，肝硬化 PHT患者及动物模型循环血中扩血管物质的含量也是增加的，如一氧化碳（carbon monoxide，CO）、一氧化氮（nitric oxide，NO）和前列环素（prostacyclin，PGI2)等，其中NO的过度生成被认为在肝硬化PHT发生发展过程中具有重要的作用。而过度生成的NO被认为主要是由于内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）的表达增加和活性增强所致。热休克蛋白90（heat shock protein90，HSP90）是热休克蛋白的一种，既往研究表明其在eNOS的表达和活化过程中都具有不可替代的作用，而也有学者发现其在PHT中的表达是升高的，但HSP90是否参与了肝硬化PHT的内脏高动力循环，以及其中的具体机制，并未阐明。
　　本实验通过检测四氯化碳（CCl4）诱导肝硬化PHT大鼠门静脉血流动力学变化，肠系膜微血管对NE的反应性变化，循环血和肠系膜动脉内NO含量以及肠系膜动脉内HSP90、eNOS和p-eNOS的蛋白表达变化，并通过比较HSP90特异性抑制剂格尔德霉素（geldanamycin，GA）干预前后上述指标的变化来探究HSP90在CCl4诱导肝硬化PHT内脏高动力循环中的作用及可能的机制。
　　第一部分：四氯化碳致肝硬化门静脉高压症大鼠模型的制备及微血管灌流孵育系统的建立
　　目的：探究CCL4背部皮下注射制备肝硬化门静脉高压症大鼠模型的可行性以及获取肠系膜微动脉后体外吗啉丙磺酸(morpholinopropanesulfonic acid，MOPS)缓冲液中测定其活性。方法：雄性SD大鼠随机分为正常对照组（normal group，N组）和肝硬化门静脉高压症组（PHT组），PHT组以60％的CCL4油溶液按照0.5ml/100g大鼠体重为标准背部皮下注射，每周2次，共16周，期间间断予5%乙醇饮用；N组以同样的方式和剂量予生理盐水背部皮下注射。造模结束后B超检测两组大鼠的门静脉血流动力学指标，多功能监测仪测定门静脉压力（portal vein pressure，PP）；解剖显微镜下取肠系膜三级动脉，置于MOPS缓冲液中，调整管腔内压力为80mmHg，构建微血管灌流孵育系统，平衡后予NE和乙酰胆碱（Acetylcholine，Ach）刺激血管，测量血管直径的变化。结果：①PHT组大鼠有消瘦，烦躁，精神萎靡，反应迟钝等现象，肝脏可见明显肝硬化结节，腹腔内有腹水，模型制备成功；②PHT组门静脉血流速度（portal vein blood flow velocity，PBV）和门静脉血流量（portal vein blood flow，PBF）明显低于N组{（2.2857±0.15736）cm/s vs（3.0571±0.16183）cm/s(p<0.01)；（1.7143±0.14875） ml/min vs（2.5714±0.15345）ml/min(p<0.01)}，门静脉直径（portal vein diameter，PVD）在 PHT组与N组之间无明显差异{（1.4012±0.08165） mm vs（1.3886±0.13801）mm(p>0.05)}，PHT组PP水平明显高于N组{（14.40±0.88） mmHg vs（7.53±0.58）mmHg(p<0.01)}；③两组大鼠肠系膜微动脉在构建好血管灌流孵育系统之后，平衡1-2小时均出现自主收缩，加入NE出现血管进一步地收缩，而加入Ach则出现血管扩张现象。结论：CCL4背部皮下注射并间断饮用乙醇可成功制备肝硬化PHT大鼠模型，体外孵育的肠系膜三级微动脉在MOPS缓冲液中存在活性。
　　第二部分：肝硬化PHT大鼠肠系膜微动脉对去甲肾上腺素的反应性以及肠系膜动脉内HSP90、eNOS和p-eNOS蛋白含量的测定
　　目的：检测PHT组大鼠和N组大鼠肠系膜微动脉对去甲肾上腺素的反应性差异、血清和肠系膜动脉内NO的含量变化以及肠系膜动脉内HSP90、eNOS和p-eNOS蛋白表达的变化。方法：建立肠系膜三级动脉的血管灌流孵育系统，测定其在不同NE浓度下的血管内径变化；取大鼠循环血及肠系膜动脉，测定其NO的含量；取肠系膜动脉，免疫印迹分析法检测其中HSP90、eNOS和p-eNOS的蛋白表达。结果：①PHT组肠系膜三级动脉的NE量-效曲线较N组明显右移，EC50值明显增大；②肝硬化PHT大鼠血清NO水平为（75.4±9.9）μmol/L，明显高于对照组大鼠血清NO水平（47.3±8.6）μmol/L（P<0.01）。③肝硬化PHT大鼠肠系膜动脉NO含量为（367.8±54.2）μmol/gprot，明显高于对照组大鼠NO含量（209.3±45.6）μmol/gprot（P<0.01）；④PHT组大鼠肠系膜动脉内HSP90、eNOS和p-eNOS蛋白表达均较N组明显上调。结论：PHT组大鼠肠系膜三级动脉对NE的收缩反应性较N组明显降低，呈现低反应性，血清和肠系膜动脉内NO水平明显升高，同时伴有HSP90、eNOS和p-eNOS的表达上调。
　　第三部分：格尔德霉素对肝硬化PHT大鼠门静脉血流动力学、肠系膜微动脉对NE的反应性以及肠系膜动脉内HSP90、eNOS和p-eNOS蛋白表达的影响
　　目的：研究HSP90在肝硬化PHT内脏高动力循环形成中的作用及可能的机制。方法：在模型制备至16周完成之后，将每组的剩余大鼠随机分为两个亚组，PHT+GA组和N+GA组，将溶解于二甲亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）中的GA以1mg/Kg大鼠体重为标准腹腔注射，每天1次，共1周；PHT+DMSO组和N+DMSO组，同样的方式和剂量予DMSO腹腔注射，每天1次，共1周。然后测定各组大鼠的门静脉血流动力学指标、门静脉压力、肠系膜微动脉对NE的反应性、血清和肠系膜动脉内NO含量及肠系膜动脉内HSP90、eNOS和p-eNOS蛋白表达。结果：①PHT+GA组与PHT+DMSO组大鼠的PBV、PBF、PBD和PP值分别为{（2.3458±0.15235） cm/s vs（2.4005±0.12436） cm/s(p>0.05)，（1.6714±0.14015）ml/min vs（1.7136±0.09412）ml/min(p>0.05)，(1.3652±0.08235） mm vs（1.3586±0.12803）mm(p>0.05)，（15.04±0.74）mmHg vs（14.43±0.63） mmHg(p>0.05)}，差异均无统计学意义；②N+GA组与N+DMSO组大鼠的PBV、PBF、PBD和PP值分别为{（3.1013±0.11275） cm/s vs（3.0571±0.09435）cm/s(p>0.05)，（2.4682±0.08641） ml/min vs（2.5427±0.11443） ml/min(p>0.05)，（1.3456±0.11254）mm vs（1.3686±0.09541）mm(p>0.05)，（7.57±0.86）mmHg vs（7.34±0.46）mmHg(p>0.05)}，差异均无统计学意义；③在PHT大鼠中，GA干预之后大鼠肠系膜三级动脉对NE的量-效曲线部分左移，EC50明显降低，差异有明显统计意义；④在N组大鼠之中，GA干预之后大鼠肠系膜三级动脉对NE的量-效曲线移动不明显，EC50无明显改变，差异无统计学意义；⑤在PHT组大鼠中，GA可使血清和肠系膜动脉内NO含量均显著降低{(62.4±8.6)μmol/L vs(78.1±11.2)μmol/L(p<0.01)，(295.8±45.7)μmol/gprot vs(369.3±54.2)μmol/gprot(p<0.01)}；⑥在N组大鼠之中，GA干预前后，血清和肠系膜动脉内NO水平分别为{(46.4±6.9)μmol/L vs(47.1±6.2)μmol/L(p>0.05)，(214.8±44.1)μmol/gprot vs(209.3±34.2)μmol/gprot(p>0.05)},差异无统计学意义；⑦PHT组中，GA干预可使肠系膜动脉HSP90、eNOS和p-eNOS的蛋白表达下调；⑧N组中，GA干预未能使肠系膜动脉HSP90、eNOS和p-eNOS的蛋白表达下调。结论：肝硬化PHT中过度生成的HSP90可能是通过增加eNOS的表达和活性的方式促进NO的合成，参与内脏动脉对缩血管物质低反应性的形成。

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前言

第一部分：四氯化碳致肝硬化门静脉高压症大鼠模型的制备及微血管灌流孵育系统的建立

材料与方法：

结果

讨论

第二部分：肝硬化PHT大鼠肠系膜微动脉对去甲肾上腺素的反应性以及肠系膜动脉内HSP90、eNOS和p-eNOS蛋白含量的测定

材料与方法

结果

讨论

第三部分：格尔德霉素对肝硬化PHT大鼠门静脉血流动力学、肠系膜微动脉对NE的反应性以及肠系膜动脉内HSP90、eNOS和p-eNOS蛋白表达的影响

材料与方法

结果

讨论

全文结论

参考文献

附：综述: 小窝蛋白、钙调蛋白和热休克蛋白90在门静脉高压症内脏及全身动脉eNOS过度活化中的作用

攻读硕士期间发表的论文

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