筛选高效低毒天花粉蛋白衍生肽诱导同种异体移植耐受的研究

摘要

天花粉蛋白（Trichosanthin，Tk）是从植物括篓根块中提取的碱性蛋白，我们前期的研究首次发现其具有免疫负向调节功能，可抑制Th1型主宰的细胞应答，是一种潜在的免疫抑制剂。然而Tk在临床使用时伴随一定的肌肉和神经毒性，因此明确 Tk分子的构效关系显得尤为重要。为此，我们对Tk进行了分段克隆和表位分析，筛选获得低毒高效的衍生肽Tk-PQ，并分析其诱导同种异体移植耐受的作用及机制，为其应用临床奠定实验基础。我们在体外建立同种异体 MLR体系，体内构建小鼠同种异体皮肤移植模型，3H-TdR掺入法检测发现Tk-PQ对MLR具有显著抑制效果，抑制率达87％（P＜0.01）；乳酸脱氢酶（LDH）及Annexin-V/PI检测法证明Tk-PQ对细胞毒性作用与对照组相比无显著性差异。皮肤移植实验表明，Tk-PQ治疗后，小鼠同种异体皮肤移植物的生存期平均由8.4天延长至22.6天（P＜0.01）；HE染色显示，治疗组移植皮肤局部炎性浸润减轻。采用real-time PCR、ELISA、FACS等方法分析发现，Tk-PQ可显著上调CD4+CD25+Foxp3+T细胞（nTreg）比例，细胞因子IL-10、TGF-β分泌水平升高，IL-2、IFN-γ、IL-17A分泌水平降低。Western blotting和co-IP结果显示，Tk-PQ可增强IRF4表达水平；此外，Western blotting和real-time PCR结果提示Tk-PQ可通过抑制I-κB磷酸化阻止NF-κB的活化入核，从而抑制NF-κB下游炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表达。由此得出以下结论，筛选出的Tk衍生肽—Tk-PQ对Th1/Th17型主宰的免疫应答具有明显免疫抑制作用，抑制效果优于全长蛋白而细胞毒性低于Tk；体内功能实验结果发现其能显著延长小鼠同种异体移植皮肤的生存期，其中可能涉及的作用机制包括：上调CD4+CD25+Foxp3+T细胞比例及细胞因子IL-10、TGF-β分泌，下调IFN-γ、IL-17A等的表达水平，增强 IRF4乙酰化水平，抑制炎性转录因子NF-κB信号途径，降低IL-6、TNF-α、IL-1β表达水平，实施免疫负向调节作用。

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缩略词表

绪论

第一部分高效低毒天花粉蛋白衍生肽的筛选

1 材料与方法

1.1 实验动物

1.2 试剂与仪器

1.3 方法

2 结果

2.1 具有免疫抑制作用的天花粉蛋白衍生肽段的筛选

2.2 Tk-PQ的抑制作用对细胞活力的影响

3 讨论

第二部分 Tk-PQ通过nTreg及增强IRF4表达发挥负向调节作用

1 材料与方法

1.1 实验动物

1.2 试剂与仪器

1.3 方法

2 结果

2.1 可溶性细胞因子参与Tk-PQ介导的免疫抑制作用

2.2 Tk-PQ诱导Th2/Treg相关细胞因子高表达，抑制Th1/Th17相关细胞因子表达

2.3 IL-10和TGF-?是Tk-PQ诱导免疫抑制的关键细胞因子

2.4 Tk-PQ上调同种异体MLR体系中CD4+CD25+Foxp3+Treg亚群比例

2.5 Tk-PQ通过抑制I?B磷酸化阻止NF-?B入核

2.6 Tk-PQ诱导转录因子IRF4高表达，且Irf4与Foxp3和Gata3的mRNA表达水平呈直线正相关

2.7 Tk-PQ能增强IRF4乙酰化水平

3 讨论

第三部分 Tk-PQ诱导小鼠同种异体皮肤移植免疫耐受

1 材料与方法

1.1 实验动物

1.2 试剂与仪器

1.3 方法

2 结果

2.1 Tk-PQ能显著延长小鼠同种异体移植皮肤的生存期

2.2 Tk-PQ明显减轻移植皮肤炎性细胞浸润

2.3 Tk-PQ诱导受体脾细胞由Th1/Th17应答向Th2/Treg应答偏移

2.4 Tk-PQ能上调CD4+CD25+Foxp3+T细胞比例

2.5 Tk-PQ增强受体脾细胞表达抑制性分子PD-1和PD-L1

2.6 Tk-PQ能通过抑制IκB磷酸化阻止NF-κB入核，降低致炎因子IL-1β、TNF-α、IL-6 mRNA表达水平

3 讨论

全文结论

参考文献

致谢

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