hWJMSCs向膀胱尿路上皮分化及抑制尿路上皮肿瘤生长的研究

摘要

第一部分hWJMSCs向膀胱尿路上皮细胞分化的研究
　　目的:脐带间充质干细胞(mesenchymalstromalcellsderivedfromhumanumbilicalcordWharton'sjelly，hWJMSCs)是一群具有多向分化潜能的原始细胞。既往的研究证实，骨髓、脂肪等组织来源的MSCs在合适的条件下可以向膀胱尿路上皮细胞分化。hWJMSCs能否被诱导分化为膀胱尿路上皮细胞尚不明确。本部分中，我们旨在评估hWJMSCs向膀胱尿路上皮细胞分化的可行性。方法:首先，我们采用组织块贴壁法在从脐带沃顿胶质中分离获取原代培养的hWJMSCs，并对其表面CD分子进行鉴定。然后，采用人膀胱尿路上皮细胞系及猪原代膀胱尿路上皮细胞来源的条件培养基、人表皮生长因子(EGF)对hWJMSCs进行诱导分化。针对定向分化过程中特定时间的hWJMSCs采用RT-PCR及细胞免疫荧光染色的方法检测其尿路上皮细胞表面标记蛋白(尿斑蛋白UPⅡ、细胞角质蛋白AE1/AE3、CK18)表达情况。结果:我们原代培养的hWJMSCs外形均一、增殖旺盛，表达MSCs相关CD分子，不表达血源性细胞CD分子。数据显示，在单独使用人膀胱尿路上皮细胞系及猪原代膀胱尿路上皮细胞来源的条件培养基或者EGF对hWJMSCs进行分化的第7天、第14天甚至第28天均没能检测出尿斑蛋白UPⅡ、细胞角质蛋白AE1/AE3、CK18的表达。而联合使用条件培养基及外源性的人EGF后，hWJMSCs在被定向诱导分化第7天即有微弱的尿斑蛋白UPⅡ、细胞角质蛋白AE1/AE3、CK18表达，当继续诱导分化至第14天时，上述蛋白标记物表达程度明显增强，并且hWJMSCs形态也由长梭形向多边形转变。
　　结论:本课题中采用的hWJMSCs原代培养方法可以成功地获取纯度较高、生长旺盛的hWJMSCs，完全可以满足本实验的需要。无论是来源于人或猪膀胱尿路上皮细胞的条件培养基还是人EGF单独使用均不足以诱导hWJMSCs向尿路上皮样细胞定向分化。而添加有人EGF的情况下，上述条件培养基则可以成功地诱导hWJMSCs向膀胱尿路上皮细胞进行分化。
　　第二部分hWJMSCs及hWJMSC-MVs抑制膀胱尿路上皮肿瘤细胞生长的研究
　　目的:有研究证实，间充质干细胞(MSCs)可以发挥抗肿瘤的作用，但其潜在的具体分子机制目前尚不明确。近些年，细胞分泌的微囊(microvesicles，MVs)被认为是细胞与细胞之间信息传递的一种新途径，因此，微囊有可能在MSCs的抗肿瘤效应中发挥了重要作用。在本部分实验中，我们旨在验证脐带来源的间充质干细胞(hWJMSCs)及脐带间充质干细胞微囊(hWJMSC-MVs)在体外及体内对膀胱尿路上皮细胞肿瘤细胞（T24细胞）生长的抑制作用，并初步探讨该现象背后的分子机制。方法:我们选用细胞共培养体系及BALB/cnu/nu裸鼠肿瘤模型分别验证在体外及体内环境下hWJMSCs及hWJMSC-MVs对膀胱肿瘤细胞生长的抑制作用。采用CCK-8试剂盒及Ki-67免疫染色的方法检测hWJMSCs及hWJMSC-MVs处理后的膀胱肿瘤细胞(T24)的增殖情况。采用流式细胞技术及TUNEL染色技术评估膀胱肿瘤细胞周期变化及肿瘤细胞凋亡指数的改变。为了探讨hWJMSCs及hWJMSC-MVs抑制膀胱肿瘤细胞生长的信号通路，我们采用Westernblot技术检测膀胱肿瘤细胞暴露于hWJMSC-MVs24h、48h、72h后Akt/p-Akt、p-p53、p21及Caspase3的活化及表达变化。结果:实验数据显示，膀胱肿瘤细胞经过hWJMSCs及hWJMSC-MVs处理后，其增殖率明显下降，细胞周期被阻滞于G0/G1期，肿瘤细胞凋亡指数增加。Westernblot检测显示，hWJMSC-MVs降低了肿瘤细胞Akt磷酸化水平，激活了p53、p21及Caspase3。在动物模型中，同时皮下注射hWJMSCs或hWJMSC-MVs组的裸鼠，肿瘤成瘤率降低、瘤体体积减小。
　　结论:hWJMSCs及hWJMSCs-MVs通过阻滞肿瘤细胞周期并促进其凋亡的方式抑制膀胱肿瘤细胞的生长。并且，hWJMSC-MVs的抗肿瘤效果比hWJMSCs更直接和明确。这说明hWJMSC-MVs是hWJMSCs的肿瘤抑制效应的主要介导者之一。hWJMSC-MVs有可能为将来临床上治疗肿瘤提供一种有效的手段。

目录

声明

摘要

符号说明

绪论

第一部分 hWJMSCs向膀胱尿路上皮细胞分化的研究

第一章 hWJMSCs分离、扩增及鉴定

1．1 实验材料

1．2 实验方法

1．3 实验结果

1．4 讨论

1．5 结论

参考文献

第二章 hWJMSCs向膀胱尿路上皮分化的研究

2．1 实验材料

2．2 实验方法

2．3 实验结果

2．4 讨论

2．5 结论

参考文献

第二部分 hWJMSCs及hWJMSC-MVs抑制膀胱尿路上皮肿瘤细胞生长的研究

3．1 实验材料

3．2 实验方法

3．3 实验结果

3．4 讨论

3．5 结论

参考文献

全文总结

致谢

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