Stat3信号通路与表现遗传修饰影响大肠癌生物学功能的机制研究

摘要

第一部分:EZH2/H3K27me3与IL-6/Stat3信号通路影响大肠癌生物学功能的研究
　　目的:研究EZH2在大肠癌中的生物学功能以及与Stat3信号通路之间的相互调控关系。
　　方法:利用免疫蛋白印记(WesternBlot)以及Real-timePCR分析相关分子在大肠癌细胞及组织中相关的蛋白以及mRNA水平;酶联免疫吸附试验检测基质金属蛋白酶的分泌;TransWell侵袭试验分析细胞的侵袭转移能力;运用同位素氚掺入法检测细胞增殖情况;流式细胞分析Annexin-(V)/PI细胞染色以检测细胞凋亡情况;采用以慢病毒为载体的shRNA干扰技术，感染大肠癌细胞株，从基因水平特定的敲除该基因的表达;运用染色质免疫沉淀的方法分析相关基因启动子区的组蛋白甲基化水平;双荧光素酶报告基因分析相关基因启动子区的活性;免疫组化染色分析大肠癌组织中相关蛋白的表达;采用SPSS13.0统计软件统计以上的结果。
　　结果:敲除大肠癌细胞内EZH2的表达，可降低大肠癌的细胞增殖，侵袭以及抗凋亡的能力并且伴随基质金属蛋白酶(MMP)的分泌减少。敲除细胞内EZH2的表达，VDR的表达升高;荧光素酶报告基因检测VDR启动子区活性增加，同时VDR启动子区H3K27me3水平降低。敲除细胞内Stat3的表达，EZH2的表达一致性降低;反之，过表达细胞内Stat3水平，则EZH2表达亦升高。染色质免疫沉淀结果提示，Stat3可直接与EZH2启动子区的特定位点相结合。临床研究结果显示，磷酸化Stat3与EZH2在大肠癌组织中的表达较正常组织升高，且与肿瘤的病理分期转移相关。
　　结论:Stat3信号通路在大肠癌中的活化可促进EZH2的表达，并且Stat3可与EZH2的启动子区相互结合，从而阐释了组蛋白甲基化与信号通路之间的相关性。EZH2可促进大肠癌的细胞增殖能力、抗凋能力以及侵袭转移功能，该功能与EZH2/H3K27me3调控细胞周期蛋白抑制基因以及VDR的表达相关，其中VDR为EZH2新发现的靶基因。因此，EZH2可能成为大肠癌新的治疗靶点。
　　第二部分:IL-22介导的Stat3信号通路与组蛋白甲基修饰对大肠癌生物学功能的影响及其机制
　　目的:白介素IL-22(interleukin-22)是最新发现的一种细胞因子，人类IL-22的结构与IL-10有一定的同源性(22％)。IL-22不仅可以调节上皮的固有免疫反应，而且可以抵抗革兰氏阴性菌对黏膜的损伤，并可以促进受损组织的愈合等。但IL-22在大肠癌微环境中的来源，影响大肠癌的生物学功能以及与临床的相关性还未被报道过。
　　方法:利用流式细胞仪分析大肠癌组织或者外周血中分离的免疫细胞以及肿瘤干细胞的细胞表型，同时检测细胞因子的表达情况。实时定量PCR、免疫蛋白印记以及酶联免疫吸附试验分析细胞因子或者基因以及蛋白的表达水平。以同位素氚掺入法检测细胞增殖能力，并利用定量PCR检测细胞周期相关基因的改变。用染色质免疫沉淀研究特定基因启动子区组蛋白甲基化水平。通过体外模拟肿瘤干细胞小体实验检测IL-22对大肠癌干细胞的影响。采用小鼠移植瘤动物模型分析IL-22动物肿瘤形成的影响。
　　结果:流式细胞术以及Real-TimePCR分析大肠癌组织以及健康外周血细胞中IL-22的表达，显示IL-22在大肠肿瘤中的表达较正常对照者明显增高。Th22（CD3+CD4+IL-22+）为大肠肿瘤微环境中IL-22的主要细胞来源，流式细胞术结果表明Th22的主要细胞表型为CD103+CCR6+CCR4+CD49d+CXCR3-。Th22/IL-22在介导大肠癌细胞分子生物学功能上有重要的作用。IL-22可以明显增加大肠癌肿瘤干细胞小体的数量，体内促进肿瘤的生成并增加肿瘤的大小。同时IL-22可以显著提高大肠癌细胞增殖能力，但对化疗诱导的凋亡作用不明显。IL-22对大肠癌生物学行为的影响依赖于Stat3信号通路的激活。敲除Stat3的表达，IL-22促进大肠癌干细胞特性以及细胞增殖能力的功能均降低甚至消失。从表观遗传学角度研究发现，IL-22可提高肿瘤干细胞关键基因(Nanog、OCT3/4、Sox2)启动子区H3K79me2水平，从而使得干细胞关键基因呈活化状态。ChIP结果显示IL-22促进肿瘤干细胞的功能是H3K79me2依赖的。IL-22可以促进PRC2蛋白的表达，并导致细胞周期蛋白抑制因子p16INK4A、p21WAF1的H3K27me3水平明显增高。ChIP以及细胞增殖试验结果显示IL-22诱导的大肠癌细胞增殖能力的功能依赖于PRC2/H3K27me3对细胞周期蛋白抑制因子的影响。
　　结论:Th22细胞来源的IL-22可以促进大肠肿瘤干细胞的形成以及肿瘤的进展，且该功能依赖于STAT3信号通路的活化。表观遗传修饰分析显示，IL-22促进肿瘤干细胞的功能与肿瘤干细胞关键基因的H3K79me2水平有关。而IL-22促进大肠癌细胞的增殖与细胞周期蛋白抑制因子p21WAF1、p16INK4A启动子区H3K27me3的增加有关。IL-22/Th22相关的信号通路可能为大肠癌的治疗提供一定的基础。

目录

声明

摘要

文缩略词中英文对照

绪论

第一部分 EZH2／H3K27me3与IL-6／Stat3信号通路对大肠癌生物学行为的影响及其作用机制研究

前言

第一章 材料和方法

1．1．1 材料

1．1．2 方法

第二章 结果

1．2．1 Stat3信号通路在大肠癌组织和细胞中持续激活

1．2．2 转录因子Stat3可以调控EZH2的表达

1．2．3 EZH2在大肠癌组织和细胞中的表达升高

1．2．4 EZH2影响大肠癌细胞的生物学行为

1．2．5 VDR可能为EZH2新的靶基因

第三章 讨论

第二部分 IL-22介导的Star3信号通路与组蛋白甲基修饰影响大肠癌生物学功能的作用研究

前言

第一章 材料和方法

2．1．1 材料

2．1．2 方法

第二章 结果

2．2．1 Th22细胞是IL-22在大肠癌微环境中的主要细胞来源

2．2．2 Th22细胞在大肠癌微环境中浸润的机制以及TH22主要的细胞表型

2．2．3 Th22／IL-22促进了大肠癌干细胞特性

2．2．4 IL-22促进大肠癌细胞的增殖能力

2．2．5 IL-22促进大肠癌干细胞的功能与干细胞关键基因启动子区H3K79me2的增加有关

2．2．6 IL-22促进大肠癌细胞增殖的能力依赖于PRc2／H3K27me3

2．2．7 IL-22诱导的大肠癌肿瘤干细胞以及细胞增殖方面的功能呈Stat3信号通路依赖性

第三章 讨论

综述 PcG蛋白诱导的基因沉默与肿瘤的关系

参考文献

致谢

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