在异源表达菌株中对杀稻瘟菌素生物合成基因簇的研究

摘要

杀稻瘟菌素(BS)是一种典型的肽核苷类抗生素。1958年,由日本科学家在寻找有机汞农药的替代试剂的实验中从 Streptomyces griseochromogenes中先发现并分离得到。由于它对环境友好,因此在农业上被大规模用于防治稻瘟病等,不仅如此,近年它作为筛选标记被越来越多的用于真核细胞研究。对杀稻瘟菌素生物合成途径的研究始于1958年,1998年该抗生素的基因簇被克隆,2003年根据基因簇的测序分析和对 Bls M的体外表征对生物合成途径进行了推导。但是由于在天然产生菌S. griseochromogenes中进行遗传操作特别困难,所以对杀稻瘟菌素生物合成的研究进展缓慢。最近,吴俊和李力等通过4次同源交换,将杀稻瘟菌素的合成基因簇嫁接到了S. lividans1326中的染色体上得到了产生杀稻瘟菌素的突变株WJ2。
　　在杀稻瘟菌素的工程菌株 WJ2中,我们通过 blsA、blsB、blsC和 b lsN的体内基因置换确定了杀稻瘟菌素合成的必需基因为b lsD与b lsM之间的十个基因。为了了解杀稻瘟菌素生物合成途径,我们分别对三个必需基因blsG(编码精氨酸2,3-变位酶)、blsH(编码氨基转移酶)、b lsK(编码未知功能蛋白)分别进行敲除,结果只在 b lsK的突变株中检测到了脱甲基杀稻瘟菌素(DBS)和少量杀稻瘟菌素(BS)的积累。由于以前推导的 BS生物合成途径,没有直接证据证明精氨酸 b eta位氨基亮氨酸酰化和精氨酸胍基甲基化这两个反应的时间先后。体内b lsK突变株积累DBS和BS这一结果与以上有争议的步骤有关。我们以前推测:在异源表达菌株中发现的亮氨酸酰化的杀稻瘟菌素(LBS)不是途径专一性的中间体,而是由生物合成基因簇以外的基因产生的。将S.lividans中含有的与Streptoverticillum中发现的杀稻瘟菌素乙酰转移酶的同源蛋白敲除之后,发现其突变株 DAQ13仍然产生LBS,暗示LBS的生成仍可能是由BS基因簇内部编码的蛋白控制的。为了确定亮氨酸酰化和甲基化的先后顺序,我们对甲基转移酶BlsL在大肠杆菌中进行融合表达并纯化。在体外实验中,BlsL可以使亮氨酸酰化的杀稻瘟菌素(LDBS)甲基化为 LBS,但不能使 DBS甲基化,这说明是 LDBS先被甲基化生成 LBS, LBS最终再水解得到有活性的BS的。之前的生物活性实验表明,BS的生物活性比DBS稍高, LDBS的生物活性最低。据我们所知,这也是抗生素产生菌自我保护机制中通过加载氨基酸修饰使抗生素失活最终再释放出活性的抗生素的第一例。

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第一章 文献综述

1.1 异源表达简介

1.2 肽核苷类抗生素简介

1.3 抗生素产生菌的抗性机制分类

1.4 杀稻瘟菌素研究背景和进展

1.5 本研究内容和目的

第二章 材料和方法

2.1 材料

2.2 实验方法

第三章 杀稻瘟菌素生物合成基因簇边界的确定

3.1 杀稻瘟菌素生物合成基因簇下游边界的确定

3.2 杀稻瘟菌素生物合成基因簇上游边界的确定

3.3 本章小结

第四章 生物合成基因簇中关键基因的敲除

4.1 blsG的基因置换

4.2 blsH的基因置换

4.3 blsK的基因置换

4.4 本章小结

第五章 酰基转移酶的敲除

5.1 WJ2中酰基转移酶基因位置的确定

5.3 LC-MS检测DAQ13发酵产物

5.4 本章小结

第六章 杀稻瘟菌素生物合成途径中最后一个中间体的确定

6.1 BlsL在大肠杆菌中的异源表达

6.2 BlsL的体外反应

6.3 本章小结

第七章 总结与展望

7.1 主要结论

7.2 研究展望

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文