兔脂肪干细胞与PLA-PEG共聚物生物相容性研究

摘要

目的：建立兔脂肪干细胞（rabbit adipose-derived stem cells，rADSCs）的分离培养方法，探讨rADSCs的生物学特性，及其体外复合聚乳酸-聚乙二醇共聚物（polylactide-polyethylene glycol copolymers，PLA-PEG）的生物相容性，为进一步构建脂肪干细胞组织工程化角膜组织提供实验基础。
　　方法：（1）采用胶原酶消化法及贴壁筛选法分离纯化rADSCs，采用体外诱导成骨、成脂实验对rADSCs的多向分化潜能进行验证。（2）采用不同复感染指数（Multiplicities of infection，MOI）值的慢病毒载体转染rADSCs，荧光倒置显微镜下观察绿色荧光（green fluorescence protein，GFP）表达的情况并统计其相应的转染效率，MTT法检测负载GFP的慢病毒转染对细胞生长状态的影响情况，进一步评价GFP负载慢病毒对细胞的毒性情况。（3）将转染的rADSCs接种于PLA-PEG支架上，通过Hoechst DNA定量法观察第1天至第8天材料上细胞的增殖情况；LDH细胞毒性检测评估PLA-PEG材料对rADSCs的细胞毒性；激光共聚焦显微镜、扫描电子显微镜观察接种后1,3,5和7天细胞在支架上的生长、粘附等情况。
　　结果：（1）原代rADSCs多呈短棒状、聚集生长倾向。传代后细胞均匀、呈成纤维细胞样生长。体外成脂分化诱导2周，油红O染色胞质可见红色脂滴；成骨分化诱导2周茜素红染色可见矿化结节。（2）当复感染指数MOI为50、100、500时慢病毒介导GFP均可成功转染rADSCs，MOI为100时，细胞转染效率可达50％以上且对细胞的正常生长没有显著影响。（3）MTT法显示细胞接种于PLA-PEG材料后随时间延长细胞数量增加，第7天细胞生长达到高峰。激光共聚焦显微镜显示，细胞在PLA-PEG材料上生长良好且随培养时间延长细胞数量增加。扫描电子显微镜显示，细胞在材料表面紧密贴附并分泌细胞外基质使细胞紧密生长。
　　结论：（1）采用胶原酶消化及细胞贴壁筛选可以获得了形态较为均一的rADSCs，并体外证实了其具有成骨、成脂等多向分化能力。（2）慢病毒介导GFP基因可以成功导入rADSCs且稳定表达，可作为rADSCs组织工程的细胞示踪标记，对细胞的分布及转归进行示踪。（3）rADSCs可以在PLA-PEG材料上紧密粘附并且分泌细胞外基质，细胞与材料具有较好的生物相容性，有望应用于组织工程化角膜组织的进一步研究。

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英文缩略词表

绪论

1 种子细胞

2 支架材料

3 细胞示踪标记

技术路线

第一部分 rADSCs的分离培养鉴定及GFP转染最佳条件的研究

1 序言

2 实验材料

3 实验方法

4 结果

5 讨论

章节小结

第二部分 rADSCs 与聚乳酸-聚乙二醇共聚物(PLA-PEG)的生物相容性

1 序言

2 实验材料

3 实验方法

4 结果

5 讨论

章节小结

全文结论

参考文献

附录：攻读学位期间参加的社会活动和学术活动

致谢

在校期间撰写的文章