N-硬脂酰酪氨酸介导内源性大麻素失活系统的神经保护作用及其机制研究

摘要

自上个世纪90年代初期发现了内源性大麻素系统以来，目前被证实的内源性大麻素有N-花生四烯酸乙醇胺（anandamide，AEA）和2-花生四烯酰甘油(2-arachidonoylglycerol，2-AG)，它们通过作用于大麻素受体CB1和CB2发挥生物活性。大量研究表明，内源性大麻素具有神经保护活性，因此内源性大麻素作用的内源性大麻素系统被认为是新型神经保护药物的靶点。近年来，内源性大麻素的失活系统逐渐成为上述研究的新热点。
　　在前期工作中，我们合成了一系列结构与AEA相似的脂氨基酸类化合物，研究中我们通过大鼠离体脑片的缺氧缺糖损伤和原代皮层神经元的损伤实验筛选出了具有良好的神经保护作用的N-硬脂酰酪氨酸(N-stearoyltyrosine，NsTyr)。本研究以NsTyr为研究对象，采用SD大鼠原代神经元Aβ损伤模型和OGD损伤模型探讨其神经保护活性以及其通过内源性大麻素失活系统介导的神经保护的机制。
　　第一章 N-硬脂酰酪氨酸对抗Aβ损伤和OGD损伤的神经保护作用
　　β淀粉样蛋白(Aβ)被认为是阿尔茨海默症的主要致病原因，缺血再灌注是脑卒中损伤及其炎症反应和氧化损伤的主要原因。由于缺乏有效的防治方法和手段，使得阿尔茨海默症和脑卒中影响着人们的生活质量，并造成了社会经济负担。
　　本研究采用了SD大鼠皮层神经元建立Aβ损伤模型和OGD损伤模型，评价了NsTyr的抗Aβ毒性和抗OGD损伤神经元的神经保护作用。我们采用10μg/mL Aβ(1-40)片段建立Aβ损伤模型;采用缺氧缺糖1h恢复培养24 h的处理流程建立OGD损伤模型。通过MTT检测和LDH检测，我们发现1-20μmol/L NsTyr对Aβ损伤和OGD损伤的原代皮层神经元具有保护作用，10μmol/L NsTyr对Aβ损伤和OGD损伤诱导的神经元损伤的保护作用最强;结果还验证了AEA直接给药的局限性。Western Blot检测表明NsTyr可以上调神经元中大麻素受体CB1的表达，进一步提示了NsTyr的神经保护作用与内源性大麻素系统有关。
　　第二章 N-硬腊酰酪氨酸通过抗凋亡途径对抗Aβ损伤和OGD损伤的神经保护作用
　　内源性大麻素的神经保护作用及其本身作为神经保护药物局限性的报道促使人们把研究重点放在寻找内源性大麻素介导的高效低毒神经保护剂上。
　　本文研究通过Hoechst33342染色和TUNEL荧光染色发现Aβ和OGD诱导的神经元损伤是通过凋亡途径实现的，而NsTyr确能有效抑制这两种损伤模型的神经元凋亡。在损伤后和NsTyr处理后，采用Western Blot检测促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，结果表明NsTyr可以下调损伤引起的Bax表达升高，并可上调损伤引起的Bcl-2表达降低。同样观察到NsTyr可以通过上调ERK的磷酸化达到抑制损伤诱导的细胞凋亡的作用。这些结果表明NsTyr通过抗凋亡途径发挥对抗Aβ损伤和抗OGD损伤的神经保护作用。通过MTT检测、LDH检测和Western Blot检测，发现CB1阻断剂AM251能逆转NsTyr对Aβ损伤和OGD损伤的保护作用，这进一步提示了NsTyr是通过内源性大麻素系统发挥神经保护作用的。
　　我们前期研究中得到NsTyr与CB1没有亲和力的结果，提示NsTyr不是通过与CB1结合激动大麻素信号通路发挥神经保护作用的，本章证明NsTyr是通过抗凋亡途径实现神经保护作用的，这些结果凸显了揭示NsTyr通过内源性大麻素系统发挥抗凋亡的作用机制的理论和应用价值。
　　第三章 N-硬脂酰酪氨酸通过介导内源性大麻素失活系统对抗Aβ损伤和OGD损伤诱导的神经保护作用
　　脂氨基酸能抑制AEA水解酶FAAH活性的报道，促使我们研究NsTyr对FAAH的抑制作用。
　　为了明确NsTyr对FAAH的直接抑制作用，我们通过荧光底物检测，证明NsTyr是通过抑制FAAH的活性(IC50=16.54 nmol/L)，发挥其对Aβ损伤和OGD损伤的神经保护作用。Western Blot实验结果表明NsTyr可以下调Aβ损伤和OGD损伤导致的FAAH表达的升高，提示NsTyr具有蛋白水平对FAAH表达的抑制作用;而对FAAH mRNA的检测表明，NsTyr也具有mRNA水平对FAAH表达的抑制作用。这些结果表明，NsTyr通过多种途径抑制FAAH的活性，实现其神经保护作用。为了进一步明确NsTyr对FAAH的抑制作用，我们应用了非选择性FAAH抑制剂LY2183240和选择性FAAH抑制剂URB597，对比评价分别应用抑制剂及NsTyr对Aβ损伤和OGD损伤的神经保护作用和对AEA失活途径的抑制作用。检测细胞存活率、凋亡细胞计数、检测Bcl-2、Bax及pERK蛋白表达的实验结果都表明，与URB597不同，NsTyr和LY2183240都在抑制FAAH活性的同时，阻断AMT的功能。由于LY2183240是AMT阻断剂，我们进一步考察了NsTyr对AMT的直接作用。应用3H放射性同位素检测，发现NsTyr也能通过阻断AEA膜转运体的转运功能(IC50=11.74 nmol/L)发挥其对Aβ损伤和OGD损伤的神经保护作用。实验结果表明NsTyr可以下调由Aβ损伤和OGD损伤导致的AMT上游分子iNOS表达的升高和NO总量的增加。对iNOS的mRNA的检测也进一步确认了这一结论。我们的实验结果表明了NsTyr既是FAAH抑制剂也是AEA转运体AMT的阻断剂。
　　本研究首次明确了NsTyr抑制内源性大麻素失活系统发挥对抗Aβ损伤和OGD损伤的神经保护作用。这一结果进一步丰富了NsTyr的神经保护作用的理论依据，也为了NsTyr作为内源性大麻素失活系统抑制剂的先导药物提供了更多的实验基础。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

参考文献

第一章 N-硬脂酰酪氨酸对抗Aβ损伤和OGD损伤的神经保护作用

引言

材料与方法

实验结果

讨论

参考文献

第二章 N-硬脂酰酪氨酸通过抗凋亡途径对抗Aβ损伤和OGD损伤的神经保护作用

引言

材料与方法

实验结果

讨论

参考文献

第三章 N-硬脂酰酪氨酸通过介导内源性大麻素失活系统对抗Aβ损伤和OGD损伤的神经保护作用

引言

材料与方法

实验结果

讨论

参考文献

结论

致谢

在读期间已经发表或待发表文章目录