微管结合蛋白1轻链3与PML发生相互作用并促进其生长抑制功能

摘要

微管结合蛋白1轻链3（microtubule-associated protein1 light chain3，LC3）是最早被发现定位于哺乳动物自噬体双层膜结构上的分子之一，因此，它是判断细胞自噬活性的重要指标。一系列研究显示，LC3蛋白在细胞浆及细胞核内均有分布，目前对LC3分子的功能研究主要集中在定位于胞浆中的LC3在自噬体形成中的作用；然而，对于定位于细胞核内的LC3功能研究则非常有限。本课题组先前报道，急性早幼粒细胞性白血病相关的致病性融合蛋白 PML-RAR?（promyelocytic leukemia-retinoic acid receptor alpha）的表达显著地增强多种白血病以及非白血病细胞的自噬活性，同时我们发现PML过表达能够显著的扣押部分的LC3蛋白于核中并定位至PML核体结构，提示LC3蛋白也分布于细胞核内。在本课题中，我们运用免疫共沉淀技术以及免疫荧光方法阐明早幼粒细胞性白血病（promyelocytic leukemia，PML）亚基蛋白IV能够与LC3发生相互作用，并且该效应具有一定的细胞广谱性。内源性免疫沉淀技术进一步证实，过表达的PML IV也与内源性的LC3蛋白存在相互作用，并且主要通过与LC3-II蛋白发生结合，提示与磷脂酰乙醇胺（phosphotidylethanolamine，PE）结合的LC3蛋白可能是与细胞核内的PML发生相互作用的主要形式。此外，内源性免疫荧光实验发现，生理情况下，部分内源性的PML蛋白与LC3蛋白在细胞核内发生共定位现象，并且这一共定位现象在干扰素?（interferon alpha，IFN?）诱导PML高表达的情况下增强，提示PML高表达促进该相互作用的发生。进一步的研究提示，PML与LC3的相互作用依赖于存在于PML蛋白序列中两个潜在的LC3相互作用序列（LC3 interacting region motifs，LIR motifs），然而该相互作用并不依赖于细胞自噬活性的发生。同时，我们发现PML IV与LC3的相互作用在PML蛋白实施其控制细胞生长功能方面具有重要贡献。基于PML是重要的抑癌基因，我们推测分布于细胞核内的LC3蛋白可能通过与PML发生相互作用，控制细胞生长，从而发挥PML抑制肿瘤发生和发展的功能。

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第一部分

绪论

材料与方法

1. 细胞培养和制剂

2. 质粒构建与质粒转染

3. shRNA质粒构建以及病毒包装与病毒感染

4. 免疫荧光与共聚焦显微镜

5. 蛋白裂解及免疫沉淀技术

6. 免疫印迹技术

7. 抗体

8. 统计分析

结果

1. PML IV与外源性过表达的LC3存在相互作用

2. PML IV与内源性的LC3存在相互作用

3. 过表达PML蛋白显著地募集部分LC3入核并共定位至PML NBs

4. 内源性表达的PML与LC3在细胞核内存在共定位现象

讨论

第二部分

绪论

材料与方法

1. 细胞培养和制剂

2. 质粒构建与质粒转染

3. 病毒包装与病毒感染

4. 免疫荧光与共聚焦显微镜

5. 蛋白裂解及免疫沉淀技术

6. 免疫印迹技术

7. 抗体

8. CCK8实验

9．统计分析

结果

1. PML IV与LC3的相互作用不依赖于细胞的自噬活性

2. PML IV与LC3的相互作用是通过LIR相互作用序列实现的

3 PML IV与LC3的相互作用促进PML的生长抑制功能

讨论

参考文献

致谢