来源于新生和青春前期小鼠的雌性生殖干细胞转化为多能干细胞的研究

摘要

多能干细胞如胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESCs）和诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）在细胞治疗领域具有很好的应用前景。然而，这两类细胞在未来的临床应用时，可能会受到来自伦理和安全等方面的限制。因此，目前仍需寻找新的多能干细胞来源。已有的研究表明，从新生和成年雄鼠，甚至人类男性睾丸组织中分离出的精原干细胞（spermatogonial stem cells，SSCs），不需要转基因操作，只需要将其置于ESCs培养体系，就能转化为胚胎干细胞样细胞。这种方法不仅简单而且可以弥补ESCs和iPSCs在治疗应用方面的缺陷，如无需使用胚胎作为细胞来源，得到的是患者自身特异性细胞以及无需改变基因等遗传操作。
　　我们2009年发表的工作已经显示，出生后小鼠卵巢中存在雌性生殖干细胞（female germline stem cells，FGSCs），从新生和成年小鼠卵巢中分离纯化的FGSCs可以在体外长期培养，这一成果受到来自干细胞生物学、发育生物学、生殖生物学等领域研究人员的广泛关注。最近，美国哈佛大学附属医院-麻省总医院Tilly研究组采用与我们相同的分选蛋白MVH，利用流式细胞分选技术从小鼠卵巢组织纯化出 FGSCs，从而验证了我们的工作。同时，他们利用同样的方法，还从20~30岁妇女卵巢组织中分离出人 FGSCs。根据已有的文献报道和我们的实验发现：FGSCs与SSCs具有很多的相似性，如形态大小、生长增殖方式和传递遗传信息给子代等。尽管利用SSCs转化为多能干细胞的研究受到广泛关注，但是，与SSCs对应的FGSCs能否在体外转化成多能干细胞仍不清楚。基于FGSCs与SSCs的众多相似性，本课题尝试利用体外转化方法将FGSCs体外转化为多能干细胞。
　　在本课题中，我们发现分离纯化出的新生和青春前期小鼠 FGSCs，在体外培养时，具有相似的形态特征、生长方式和基因表达模式；将稳定增殖的新生和青春前期小鼠FGSCs置于ESCs培养系统后，能够产生细胞克隆──胚胎干细胞样细胞（embryonic stem-like cells，ESLCs），我们将这种细胞命名为雌性生殖干细胞源性ES-like细胞（female germline stem cells-derived embryonic stem-like cells，fESLCs）；在FGSCs合适的起始密度范围内，组蛋白去乙酰化酶抑制剂丙戊酸和抗氧化剂维生素C能够协同促进克隆的形成及生长。
　　体外转化过程伴随着Nanog基因启动子的去甲基化；同时，fESLCs比FGSCs具有更强的碱性磷酸酶活性；fESLCs表达与ESCs相似的多能性标志物（Oct4、Nanog、Sox2、Utf1、Esg1、Rex1以及SSEA-1）；FGSCs和fESLCs均具有正常核型（40，XX）；fESLCs母本印记基因（Peg10和Igf2r）的甲基化模式无明显变化，而父本印记基因（H19和Meg3 IG）则发生部分甲基化。
　　在体外分化条件下，fESLCs能够产生类胚体，并伴随着多能性转录因子表达的下调；在特定分化培养条件下，fESLCs能够分化为三胚层细胞谱系；同时，fESLCs注射入免疫缺陷小鼠皮下后，能够产生畸胎瘤；另外，将fESLCs注射入3.5 dpc的囊胚后，能够随着胚胎的发育，不同程度的嵌合入多种组织和器官（包括生殖系）。
　　本项研究首次发现，雌性生殖干细胞能够像精原干细胞一样，在体外转化为雌性生殖干细胞源性多能干细胞。因此，该研究能为基于多能干细胞个性化治疗的再生医学应用奠定基础。另外，雌性生殖干细胞转化为多能干细胞的研究，还可用于干细胞生物学中的重编程机制研究，从而回答为何生殖系细胞能够通过转换培养条件的方式实现转化，而体细胞则需要通过外源表达多能性转录因子才能实现。

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英文名词缩写

第一章 研究背景

1.1引 言

1.2干细胞的分类

1.3多能干细胞与再生医学

1.4本研究的目的和意义

第二章 实验材料与方法

2.1技术路线

2.2实验材料

2.3实验仪器和设备

2.4实验试剂

2.5实验方法

第三章 实验结果

3.1新生和青春前期鼠雌性生殖干细胞的分离和培养

3.2雌性生殖干细胞的特征鉴定

3.3雌性生殖干细胞在胚胎干细胞培养系统中的转化

3.4雌性生殖干细胞源性ES-like细胞的多能性标志物检测

3.5雌性生殖干细胞源性ES-like细胞的核型

3.6雌性生殖干细胞源性ES-like细胞的甲基化分析

3.7雌性生殖干细胞源性ES-like细胞的体外分化能力分析

3.8雌性生殖干细胞源性ES-like细胞的畸胎瘤形成能力分析

3.9雌性生殖干细胞源性ES-like细胞的嵌合能力分析

第四章 讨论

第五章 全文总结

参考文献

附录I 设备与仪器

附录II 材料与试剂

附录III 引物序列表

攻读博士学位期间已发表或录用的论文

攻读博士学位期间参与的国家项目

致谢