多肽修饰的脂质体靶向肿瘤输送过程的研究

摘要

肿瘤是由于遗传突变和外界环境等多种因素的刺激，诱发人体自身细胞不能进行正常的生长调控，导致细胞增殖失控的疾病，是目前严重威胁人类生命的恶性疾病。化学治疗是临床上常规的治疗手段。但是普通化疗由于缺乏特异性，在杀伤肿瘤细胞的同时，也同样作用于正常组织，造成极大的毒副作用。因此如何实现体内特异性靶向肿瘤细胞的药物输送，避免对正常组织细胞功能的损害显得尤为重要。
　　目前已上市的具有肿瘤靶向性药物输送系统中，有单克隆抗体、聚合物、胶束、纳米粒和脂质体。其中脂质体药物输送系统因载体材料的安全性和生物相容性高等优势一直是研究的热点，这些不同类型脂质体包括通过EPR效应被动靶向肿瘤组织的长循环脂质体，配体修饰的主动靶向肿瘤细胞的免疫脂质体，对外界因素如光、热、磁、PH敏感的物理/化学靶向脂质体，以及具有多功能的智能（smart）脂质体等，都能有效的实现脂质体药物在肿瘤部位的聚集和释放，降低毒副作用，保护药物在体内循环系统中不被降解，延长循环时间。然而临床统计数据显示，通过系统给药后的靶向脂质体虽然能在肿瘤部位有效的聚集，但并不一能显著的全面提高患者总的生存期。因此，对于影响靶向脂质体药物在肿瘤部位的分布及其杀伤效应的生理屏障因素，需要进行系统和深入的研究。
　　在研究中，我们以EGFR为靶点，设计了配体修饰的肿瘤靶向的脂质体药物输送系统。研究表明EGFR在许多实体肿瘤中存在高表达或异常表达，与肿瘤细胞的增殖、肿瘤血管生成、肿瘤侵袭和转移以及肿瘤细胞凋亡相关。在本实验中，我们选用了通过噬菌体展示肽库筛选的靶向EGFR的十二肽 GE11（YHWYGYTPQNVI）作为配体，制备了 GE11修饰的主动靶向EGFR的脂质体输送系统，并对影响其体内外的肿瘤靶向性，抗肿瘤效果的处方因素，以及经静脉给药后，到达肿瘤细胞过程中存在的瘤内生理屏障进行了深入的研究。
　　首先，我们通过一步合成法得到高纯度的 GE11修饰的脂质材料DSPE-PEG2000-Mal-GE11，对构成脂质体的各脂质成分建立了HPLC-ELSD定量方法，考察脂质体中各脂质处方比对GE11修饰的主动靶向脂质体稳定性，粒径变化，聚集状态，包封率的影响，得到制备稳定的GE11修饰的主动靶向脂质体的各脂质处方比例范围。
　　为了考察不同表面密度多肽GE11和PEG2000修饰的脂质体对EGFR的靶向性能，我们选择了三种表达 EGFR的不同细胞株 H1299、4T1、SMMC7721,通过流式细胞仪和共聚焦荧光显微镜观察不同表面密度 GE11和PEG2000修饰的脂质体在不同细胞株中吸附和摄取的行为。我们观察到与直接作用于细胞受体的靶向配体（单克隆抗体、多肽）不同，经配体修饰的脂质体与膜表面受体结合摄取，会受到处方，细胞类型、配体在载体表面的密度等多方面因素的影响。通过体外细胞实验，筛选出了与体外EGFR高表达肿瘤细胞特异性结合最优的三个处方，其PEG与GE11的百分摩尔比分别为（3.5:0.5），（4:2），和(6:2)。
　　为了考察这三个优化处方经系统给药后在体内的分布和肿瘤靶向行为的特点。我们通过主动载药的方法制备了这三个不同处方的阿霉素脂质体。经尾静脉给药后，通过对血液和各组织中不同时间点阿霉素的含量测定，研究修饰了不同表面密度靶向配体 GE11的阿霉素脂质体在荷SMMC7721皮下移植瘤的动物模型中体内半衰期、组织分布以及由此引起的不同的肿瘤抑制效果。肿瘤体积生长抑制率和生存率结果显示，虽然经 GE11修饰的主动靶向阿霉素脂质体体内半衰期有所下降，但与只含PEG的被动靶向长循环阿霉素脂质体比，仍具有明显的抑瘤效果。
　　为了更好地观察GE11修饰的基于主动靶向机理的脂质体输送系统抗肿瘤的机理，和其向肿瘤组织内部扩散存在的生理屏障，我们对实验中抑瘤效果存在显著性差异的两个处方，在SMMC7721皮下移植瘤的分布进行了细节的研究。两个处方，一个只含4％PEG的脂质体处方，一个是含4% PEG和2%GE11脂质体处方。前者主要通过EPR效应实现在肿瘤部位的聚集，后者可以通过GE11结合肿瘤细胞的高表达的EGFR，主动靶向到肿瘤组织。
　　我们选用组织切片技术和免疫组化的方法，观察肿瘤组织的结构形态及某些特定瘤内成分对脂质体到达肿瘤组织的影响。从最终得到的CLSM图片中，我们观察到靶向EGFR的含4% PEG和2%GE11的脂质体，相比较只基于EPR效应实现肿瘤靶向的只含4%PEG的脂质体，能够更有效的在短时间内（1h）实现脂质体在SMMC7721瘤组织新生血管区的聚集。我们还对SMMC7721肿瘤组织的I型胶原纤维、IV型胶原纤维、瘤内表达的EGFR进行IHC染色标记，观察到与正常的肝组织不同，I型胶原纤维在SMMC7721肝癌组织中的表达明显增加，分布在SMMC7721肿瘤细胞球周围。这些瘤内胶原纤维的存在，使得只含4%PEG的脂质体和含4%PEG和2%GE11的脂质体都不能有效的到达肿瘤细胞。
　　为了使脂质体更均匀有效的分布在SMMC7721皮下移植瘤中，我们根据SMMC7721肿瘤的特点，选择了两种方法来观察其是否能帮助这两种脂质体向瘤间质扩散到达肿瘤细胞。一是选择尾静脉注射I型胶原酶1h后，再给予罗丹明标记的脂质体；二是选了一种证实可以促进细胞内吞的环形肽iRGD，与罗丹明脂质体同时尾静脉注射。罗丹明脂质体注射1h后的切片图谱显示，无论是I型胶原酶还是iRGD，对含4%PEG和2%GE11的脂质体在瘤内分布的影响并无影响；对只含4% PEG的脂质体脂质体， I型胶原酶对其却有着明显的影响，能促进其在血管边缘区的聚集。但是都不能有效的帮助脂质体跨过间质屏障到达肿瘤细胞。
　　从CLSM图中，我们也观察到EGFR除了在SMMC7721细胞表达外，也在瘤间质细胞过高表达。我们认为影响GE11修饰的主动靶向脂质体向瘤间质进一步扩散的主要原因是广泛表达的EGFR间质细胞形成的“受体结合的屏障”，即新生血管区高表达EGFR的基质细胞形成的一种屏障，经GE11修饰的脂质体首先会在新生血管区与其结合后，就很难进一步向瘤间质深处扩散。经GE11修饰的主动靶向EGFR阿霉素脂质体主要是通过作用于高表达EGFR的间质细胞，更有效的杀伤间质细胞，破坏肿瘤细胞赖以生存的微环境，来达到比PEG脂质体更好的抑瘤效果。
　　综上，本论文的研究主要内容：通过一步合成法得到高纯度的GE11修饰的脂质材料DSPE-PEG2000-Mal-GE11，考察了不同表面密度多肽GE11和PEG2000修饰的脂质体对EGFR的靶向性能的影响，并对GE11修饰的主动靶向阿霉素脂质体体内的药动、药效、组织分布、抗肿瘤的机理以及输送屏障进行了研究。通过对靶向脂质体在体内输送的关键环节及其影响因素进行深入研究，明确影响靶向脂质体体内输送效率的机理，可以为设计和构建优化的靶向脂质体药物载体系统奠定基础。同时也可以为其它类型的靶向制剂的设计和构建提供参考，突破肿瘤靶向制剂的瓶颈问题。

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第一章 综述

1.1 肿瘤靶向治疗

1.2 靶向脂质体技术

1.3 靶向肿瘤纳米药物的体内输送屏障

1.4 研究的目的与内容

第二章 靶向EGFR长循环空白脂质体的制备及处方研究

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.3 实验结果

4. 分析与讨论

第三章 靶向EGFR阿霉素长循环脂质体的体内外研究

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.3 实验结果

4. 分析与讨论

第四章 组织切片观察EGFR靶向的脂质体在肿瘤组织的分布

4.1 引言

4.2 材料与方法

4.3 实验结果

4.4. 分析与讨论

第五章 总结和展望

5.1 主要结论

5.2 研究展望

参考文献

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