人支持细胞和精原干细胞长期培养及其增殖机制的研究

摘要

背景与目的：
　　精子发生是精原干细胞自我更新与分化为精子的精细和复杂过程。支持细胞是精子发生微环境的重要组成部分，为精子发生提供结构、营养和免疫支持。精原干细胞可以通过有丝分裂和减数分裂分化为精子细胞。最近研究表明，精原干细胞可以去分化生成胚胎样干细胞或转分化为其他多种组织的细胞；支持细胞可以重编程成为神经干细胞。因此，精原干细胞和支持细胞在生殖医学和再生医学中均具有重要的研究意义和应用前景。但是由于人睾丸组织的获取十分困难，关于人类支持细胞和精原干细胞的相关研究相对有限。传统观点认为，支持细胞为终末分化细胞，它们在体外不能增殖。精原干细胞在睾丸组织中数量非常少，目前尚未建立其长期的体外培养体系。因此对人支持细胞和精原干细胞进行分离、鉴定、长期培养并探索其增殖机制的研究十分必要。本研究通过从精子发生过程正常的梗阻性无精子症患者的睾丸组织中分离人支持细胞和精原干细胞，并对其进行鉴定、长期培养和相关增殖信号通路的检测，旨在为人支持细胞和精原干细胞的基础研究和临床应用提供细胞来源，并为它们的增殖机理提供新的信号转导机制。
　　第一部分人支持细胞分离、鉴定、长期培养及其增殖机制的研究
　　目的：对人支持细胞进行分离、鉴定和长期培养，并探索其培养后的基因组稳定性和增殖信号转导机制。
　　方法：两步酶消化和差速贴壁的方法分离人支持细胞，并对其进行鉴定和长期培养，通过微阵列（基因芯片）、RT-PCR、免疫细胞化学与Western Blots等技术，比较培养第1代、第5代和第10代人支持细胞基因与蛋白的差异表达。
　　结果：通过对人支持细胞进行分离、鉴定和长期培养并对不同培养代数的支持细胞的形态学、生化表型以及AKT和SMAD1/5磷酸化比较，得到以下结果：（1）两步酶消化联合差速贴壁的方法可以获得高纯度和高活性的人支持细胞。（2）在体外对人支持细胞进行长期培养至2个月，可大量扩增人支持细胞。（3）长期培养的支持细胞的大规模基因谱和重要蛋白如 GDNF、SCF和BMP4等稳定表达，同时 AKT和SMAD1/5等信号通路持续被激活。
　　结论：人支持细胞可在体外成功进行分离、长期培养扩增获得大量的细胞，并维持稳定的基因与蛋白表达。AKT和SMAD1/5信号通路参与人支持细胞增殖的调控。本研究可为人支持细胞在基础研究和临床的应用提供大量的细胞来源，为支持细胞的增殖机制提供信号转导机制。
　　第二部分人精原干细胞分离、鉴定、长期培养及其增殖机制的研究
　　目的：分离和鉴定人精原干细胞，建立精原干细胞长期培养体系并探索其自我更新机制。
　　方法：通过两步酶消化联合差速贴壁和免疫磁珠分选的方法从人睾丸组织分离得到 GPR125+的精原细胞，并进行鉴定、长期培养和信号通路的检测。
　　结果：（1）两步酶消化、差速贴壁和免疫磁珠分选方法可以分离得到高纯度和高活性的人 GPR125+精原细胞。（2）使用水凝胶和添加多种生长因子及添加物对人 GPR125+精原细胞进行培养，细胞能够增殖并形成细胞克隆，细胞可培养二个月。（3）长期培养后的细胞仍然保持了人精原干细胞的生化表型。（4） SMAD3和AKT信号通路在人GPR125+精原细胞培养与增殖中被激活。
　　结论：我们成功分离人精原干细胞，水凝胶条件培养体系可以维持人精原干细胞体外增殖和长期培养并维持其生化表型，SMAD3和AKT相关信号通路可能参与人精原干细胞的自我更新。本研究可为人精原干细胞在基础研究和生殖医学与再生医学提供细胞来源，为精原干细胞的自我更新机制提供新的信号转导机理。

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符号及缩略词说明

前言

第一部分 人支持细胞分离、鉴定与长期培养及其增殖机制的研究

1.1 研究背景

1.2 材料与方法

1.3 结果

1.4 讨论

1.5 结论

第二部分 人精原干细胞的培养及其自我更新机制的研究

2.1 研究背景

2.2 材料与方法

2.3 结果

2.4 讨论

2.5 结论

全文结论

参考文献

附录

附录1. 攻读硕士学位期间发表的学术论文

附录2.攻读硕士学位期间参加的科研项目

附录3. 攻读硕士学位期间获得的荣誉

致谢