卵母细胞玻璃化冷冻对卵子特异性基因表达的影响

摘要

近年来辅助生育技术（assisted reproductive technology，ART）及其衍生技术迅速发展，从最初的体外受精-胚胎培养（IVF-ET），到逐渐发展成熟的单精子卵泡浆内注射（ICSI）、冷冻胚胎移植（FET），再到近年来不断推广应用的胚胎植入前遗传学诊断/筛查（PGD/PGS）等，生殖相关技术难题逐渐得到攻克，并使越来越多的不孕不育夫妇从中受益。
　　配子和胚胎冷冻技术是生育力保存和辅助生殖领域的重要组成部分，其中胚胎的程序化冷冻和玻璃化冷冻目前已常规应用于世界各地的辅助生育中心，而卵母细胞因其体积大、含水量多、细胞核无核膜包绕保护、膜的渗透性低等特点，被相关领域研究者认为是最难成功冻融的细胞类型。既往多项研究表明，在卵母细胞的冻存和复苏中，玻璃化冷冻技术较程序化慢速冷冻技术更为高效，由此可见，卵母细胞玻璃化冷冻技术的成功应用不仅对人类辅助生育技术的完善和发展有重要意义，对核移植工程和珍稀物种生殖资源的保存亦有重要推进作用。
　　玻璃化冷冻技术是应用高浓度冷冻保护剂置换胞液中的水分，使细胞在超速冷冻降温过程中避免胞内冰晶形成进而导致冷冻损伤的技术。然而，卵母细胞超快速冻融过程和玻璃化冷冻保护剂本身均会对卵母细胞内部超微结构及附属结构（如透明带、纺锤体、细胞骨架等）带来一定损伤，进而影响复苏率、体外受精后的受精率及早期胚胎发育潜能。国内外在卵母细胞冷冻技术领域的研究多集中于比较两种冷冻方法（程序化慢速冷冻及玻璃化冷冻）或不同冷冻载体的冷冻效率、冷冻复苏体系的建立和改进等方面，针对冷冻技术对卵母细胞产生影响的具体机制如基因表达、表观遗传修饰等方面则研究较少。卵母细胞特异性发育相关基因是一类卵母细胞内特有的、参与卵泡生成与成熟、受精与早期胚胎发育过程的关键基因。而目前国内外将这类基因表达结合玻璃化冷冻技术的研究很少。本研究将成熟期（MII）卵母细胞分别行冷冻-复苏液处理和玻璃化冷冻-复苏，与新鲜 MII卵母细胞比较体外受精后早期胚胎发育情况及卵母细胞特异性发育相关基因 H1foo、Bmp15、Gdf9、Sohlh2、Nobox表达水平，探索玻璃化冷冻-复苏液毒性及玻璃化冷冻-复苏技术对小鼠成熟期卵母细胞体外受精后早期胚胎发育潜能及卵母细胞特异性发育相关基因表达的影响，并通过比较H1foo-α基因在新鲜及玻璃化冷冻-复苏后MII期卵母细胞中的甲基化水平差异，初步探索玻璃化冷冻影响卵子特异性组蛋白H1foo表达的机制。
　　本研究首先将C57BL/6小鼠成熟期卵母细胞随机分为新鲜对照组、冷冻复苏液处理组及玻璃化冷冻复苏组，各组分别取40枚进行卵子特异性基因 H1foo、Bmp15、Gdf9、Sohlh2、Nobox的mRNA表达水平。发现 H1foo亚型 H1foo-α在冷冻复苏组的表达显著低于冷冻复苏液处理组及新鲜对照组(P＜0.05)，而另一亚型 H1foo-β及其他四个卵子特异性基因Bmp15、Gdf9、Sohlh2和Nobox的mRNA表达在组间无显著差异（P>0.05）。应用western blot实验研究H1foo的蛋白表达水平在新鲜组及玻璃化冷冻复苏组是否有差异，结果显示，与Real-time PCR结果一致，H1foo-α的蛋白表达水平在玻璃化冷冻复苏组显著低于新鲜组。
　　进一步检测H1foo基因启动序列的甲基化程度，发现在该测序区段内，玻璃化冷冻组100枚MII期卵母细胞的甲基化程度（87.5％）较新鲜组100枚MII期卵母细胞的甲基化程度（75%）高，但差异无统计学意义（P>0.05）。
　　在第二部分实验中，197枚成熟期卵母细胞随机分为三组，新鲜对照组64枚，冷冻复苏液处理组65枚，玻璃化冷冻复苏组68枚，行体外受精比较三组卵母细胞所获早期胚胎的2-细胞率及囊胚率。应用冷冻-复苏液处理后的卵母细胞体外受精后，其2-细胞率（卵裂率）与囊胚率分别为77.42%及56.25%，与新鲜对照组2-细胞率（81.25%）及囊胚率（57.7%）相比无统计学差异（P>0.05）。而冷冻复苏后的卵母细胞体外受精后，其2-细胞率（63.93%）较新鲜对照组及冷冻复苏液处理组均显著下降(P＜0.05)，而囊胚率（53.84%）较新鲜组及冷冻复苏液处理组有下降趋势，而差异无统计学意义（P>0.05）。
　　综上，本研究发现，玻璃化冷冻-复苏液对卵母细胞体外受精后卵子特异性基因表达及早期胚胎发育无显著影响（P>0.05），而冷冻复苏这一过程会降低H1foo-αmRNA和蛋白表达水平（P＜0.05）及体外受精后2-细胞率（P＜0.05），在对改变H1foo表达机制的初步研究中发现，H1foo在玻璃化冷冻-复苏后的甲基化程度升高，但差异无统计学意义（P>0.05）。

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符 号 说 明

前言

1.小鼠卵泡发育及卵母细胞研究概况

2.玻璃化冷冻的研究进展

3.卵母细胞冷冻的研究概况

4．卵母细胞特异性基因研究概况

材料与方法

1. 实验材料

2.实验方法

结果

1.各卵母细胞特异性基因mRNA相对表达量的比较

2.H1foo两个亚型在新鲜和冷冻复苏后MⅡ卵母细胞中蛋白表达比较

3.H1foo基因甲基化在玻璃化冷冻组与新鲜组的水平

4.三组MII卵母细胞体外受精后2-细胞率及囊胚率的比较

讨论

1. 卵母细胞玻璃化冷冻技术的安全性

2.卵母细胞中关键的卵子特异性基因

3.卵母细胞特异性连接型组蛋白H1foo的研究

4.H1foo的表观遗传修饰

5.展望——GV期卵母细胞冷冻及H1foo表达的相关性

结论

参考文献

附录 综述: 卵子特异性连接组蛋白H1foo在卵子与早期胚胎发育中表达及功能的研究进展

致谢

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