乳酸在肿瘤适应葡萄糖缺乏中的作用及其机制研究

摘要

肿瘤组织以快速增长为其基本特征，因此与正常组织相比，肿瘤组织需要大量的新生血管为它提供营养。但是肿瘤的新生血管往往结构紊乱且功能不全，新生血管的生长速度也远远跟不上肿瘤生长的需要。因此，肿瘤组织离血管较远的部分存在于低葡萄糖的环境中，据相关文献报道，结肠癌和胃癌组织中心的葡萄糖浓度分别仅有0.12和0.4mM。但是处在缺乏葡萄糖环境中的肿瘤组织依然能够生存。在体内，肿瘤能够调节自己适应葡萄糖缺乏的环境，但是在体外培养的环境中肿瘤细胞缺乏葡萄糖供给时则无法生存。肿瘤在体内是如何适应葡萄糖缺乏的环境，以等待血管新生获得能量，这一问题的深入研究对于揭示肿瘤发生发展机理显得尤为重要。
　　Otto Warburg首先观察到即使在氧气充足的环境中，肿瘤仍然倾向于利用糖酵解途径作为分解葡萄糖的主要方式。肿瘤这种特殊的代谢方式的转换，就导致了糖酵解的产物乳酸的积聚。已有一些研究报道:在人宫颈癌、头颈部肿瘤、直肠癌、非小细胞肺癌中乳酸水平升高与较高的转移率和较差的临床预后相关。一些研究指出乳酸可以被肿瘤细胞利用，通过氧化磷酸化产生ATP，从而为肿瘤细胞供能。乳酸也可以作为信号分子发挥作用，例如促进内皮细胞分泌VEGF，它可以促进肿瘤细胞迁移和刺激血管生成。乳酸还可以抑制活化的T细胞，帮助肿瘤细胞完成免疫逃逸。
　　在实体肿瘤中，同时存在这样的情况:一方面，血管的发育生长是远远跟不上肿瘤的快速生长，导致肿瘤组织内存在葡萄糖缺乏区域;另一方面，在周边血管丰富的区域，葡萄糖供给充足，肿瘤细胞通过有氧糖酵解产生了大量的乳酸。这些乳酸分泌到细胞之间，对于缺少葡萄糖供给的肿瘤组织有重要病理生理作用。本研究将从体外培养中从细胞水平验证乳酸对于肿瘤细胞应对葡萄糖缺乏的作用，并探讨乳酸是如何调节肿瘤细胞适应葡萄糖缺乏，进一步从分子水平揭示乳酸调节的可能信号通路，并从动物模型中验证我们的结果。本研究有助于揭示乳酸参与肿瘤发生发展过程，为预测和治疗肿瘤提供了新靶标。
　　第一部分乳酸维持肿瘤细胞在葡萄糖缺乏中生存
　　为了探究乳酸在肿瘤细胞抵抗葡萄糖饥饿中的作用，我们首先在无糖完全培养基中培养人肺腺癌细胞系A549细胞，并添加不同浓度的乳酸。发现添加乳酸能够显著延长A549细胞在无糖培养基的存活时间。其中在乳酸浓度为20mM的无糖培养环境中A549细胞的生存时间最长。对于其他四种肿瘤细胞系也具有同样的效果，表明乳酸能够帮助肿瘤细胞在葡萄糖缺乏的环境中生存。进一步我们发现内源性乳酸也具有同样的作用，并且乳酸的作用需要氢离子与乳酸根离子共同参与。
　　接下来的实验中为了证实在无糖环境中乳酸是否是作为能量底物为肿瘤细胞提供能量，我们发现同样浓度的丙酮酸并不能如乳酸一样延长肿瘤细胞在无糖环境中的生存时间，而且采用Seahorse Bioscience XF24生物能量检测仪检测添加乳酸前后肿瘤细胞的氧气消耗并没有明显的变化，在培养基中添加的乳酸在长时间的培养过程中也没有出现明显的消耗，采用干扰RNA技术下调乳酸进入细胞的主要转运体MCT1和MCT4也没有明显影响乳酸的作用。在乳酸的调节下，无糖环境中A549细胞的糖酵解、有氧糖代谢、磷酸戊糖途径的关键酶基因表达均出现了降低。与乳酸相比，2-DG（糖酵解抑制剂）和鱼藤酮（有氧呼吸抑制剂）在无糖环境中对肿瘤细胞生存时间的延长作用要小得多。因此，乳酸确实在无糖环境中降低了肿瘤细胞的糖代谢水平，但是其调节程度并不足以解释乳酸长时间延长肿瘤细胞在无糖环境中生存的作用。
　　进一步，我们通过流式细胞仪检测细胞的凋亡情况，结果发现在乳酸的参与下无糖环境中A549细胞的凋亡比例明显下降，这种明显的凋亡减少使得肿瘤细胞在无糖环境下长期生存。
　　第二部分乳酸通过Bcl-2途径抵抗肿瘤细胞因葡萄糖缺乏引起的凋亡
　　在第一部分的实验中，我们发现乳酸对不同肿瘤细胞株的作用有差异，对DU145、A549和H1299细胞株的增殖速度和生存时间明显大于PC3和U87-MG细胞株，据此将肿瘤细胞株分乳酸敏度组和不敏感组。在比较了上述二组细胞株的遗传学背景之后，我们通过Western blot检测发现与乳酸敏感组的细胞株相比，乳酸不敏感组的PC3和U87-MG的AKT磷酸化增多。接着我们分别使用了AKT抑制剂哌立福新和激活剂胰岛素样生长因子1，证实乳酸可以活化AKT。
　　为进一步揭示乳酸活化AKT抗凋亡的具体信号传过通路，我们对ATK的上下游分子分别作了筛查验证。首先，通过使用PI3K抑制剂证实乳酸能够通过PI3K显著并迅速的引起AKT在苏氨酸308位点和丝氨酸473位点的磷酸化从而将其活化。然后，通过Western blot， RNA干扰技术和流式细胞仪检测技术，我们证实了乳酸可通过上调Bcl-2的蛋白表达抵抗肿瘤细胞在无糖环境中的细胞凋亡，并且证实Bcl-2上调与mTOR活化有关。最后，通过检测线粒体释放细胞色素C情况和Caspase9的活性，证实乳酸上调Bcl-2通过抑制细胞色素C/凋亡蛋白酶活化因子-1/Caspase9凋亡途径从而抵抗肿瘤细胞的凋亡。至此，我们发现并证实了PI3K/AKT/mTOR/Bcl-2信号通路在乳酸抵抗肿瘤细胞因葡萄糖缺乏引起凋亡过程的确切机制。
　　第三部分乳酸在肿瘤适应葡萄糖缺乏中作用的体内实验研究
　　为验证我们在体外发现的乳酸促肿瘤生存现象和PI3K/AKT/mTOR/Bcl-2信号通路参与的抗凋亡机制，我们设计了乳酸作用荷瘤裸鼠动物实验。建立裸鼠皮下肺癌移植瘤模型，在瘤周皮下注射乳酸和生理盐水处理，结果发现乳酸促进裸鼠A549肺癌皮下移植瘤生长，减少荷瘤鼠的生存期，减少裸鼠A549肺癌皮下移植瘤坏死。
　　TUNEL和Caspase3/7检测证实乳酸减少裸鼠A549肺癌皮下移植瘤凋亡。移植瘤的病理切片进行免疫组化染色分析，结果发现乳酸组与生理盐水组相比，Phospho-AKT(Thr308), Phospho-AKT(Ser473), Bcl-2和Phospho-mTOR(Ser2448)的表达均增多，证实乳酸促进裸鼠A549肺癌皮下移植瘤内PI3K/AKT/mTOR/Bcl-2信号通路活化。
　　结论
　　1.乳酸能够维持肿瘤细胞在无糖环境中长时间生存，其功能与内源性乳酸相似，是由氢离子与乳酸根离子共同的效果。乳酸并不直接为肿瘤细胞提供能量，但降低了肿瘤细胞的糖代谢水平。在无糖环境中乳酸主要通过减少肿瘤细胞凋亡来维持其生存。
　　2.乳酸通过PI3K/AKT/mTOR/Bcl-2信号通路调节肿瘤细胞减少因葡萄糖缺乏引起的细胞凋亡，乳酸通过上调Bcl-2抑制细胞色素C/凋亡蛋白酶活化因子-1/Caspase-9凋亡途径。
　　3.乳酸促进裸鼠A549肺癌皮下移植瘤生长，减少荷瘤鼠的生存期，减少裸鼠A549肺癌皮下移植瘤坏死和凋亡。乳酸促进裸鼠A549肺癌皮下移植瘤内PI3K/AKT/mTOR/Bcl-2信号通路活化。
　　创新点
　　1.发现并证实乳酸参与肿瘤发生发展过程，为预测和治疗肿瘤提供了新靶标。
　　2.发现并证实在无糖环境中乳酸并不直接为肿瘤细胞提供能量，乳酸通过降低肿瘤细胞的糖代谢水平，减少肿瘤细胞凋亡来维持其生存。
　　3.初步揭示了乳酸促肿瘤生存作用的分子机制。乳酸通过PI3K/AKT/mTOR/Bcl-2信号通路调节肿瘤细胞减少因葡萄糖缺乏引起的细胞凋亡，通过上调Bcl-2抑制细胞色素C/凋亡蛋白酶活化因子-1/Caspase-9凋亡途径。

目录

声明

中英文名词对照及缩略语表

摘要

绪论

第一部分 乳酸维持肿瘤细胞在葡萄糖缺乏中生存

引言

材料与方法

结果

讨论

小结

第二部分 乳酸通过Bcl-2途径抵抗肿瘤细胞因葡萄糖缺乏引起的凋亡

引言

材料与方法

结果

讨论

小结

第三部分 乳酸在肿瘤适应葡萄糖缺乏中作用的体内实验研究

引言

材料与方法

结果

讨论

小结

全文总结与展望

参考文献

综述 以乳酸为靶点的肿瘤治疗研究进展

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致谢