人脐带间质干细胞分泌的微囊减轻大鼠缺血再灌注引发的急、慢性肾损伤的机制研究

摘要

第一部分人脐带间质干细胞分泌的微囊通过抑制NOX2的表达减轻氧化应激改善缺血再灌注引发的急、慢性肾损伤
　　目的:
　　评估人脐带间充质干细胞(human Wharton-Jelly mesenchymal stromal cells，huWJ-MSC)分泌的微囊(micro-vesicles，MVs)对大鼠缺血再灌注引发的急慢性损伤的治疗作用，并进一步探讨其潜在机制。
　　方法:
　　从人类脐带内分离培养脐带间充质干细胞，培养3-6代后无血清饥饿24小时后取其条件培养基(conditional medium，CM)，应用差速离心法从中分离提纯微囊，并蛋白定量。8周龄成年SD大鼠分为假手术组，实验组和对照组，并建立单侧肾脏缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury，IRI)模型（保留右肾，左肾缺血1小时后再灌注）;实验组再灌注时立即从尾静脉注射100μg MVs，对照组注射相同容积的M199细胞培养液。分别在再灌注后24小时，48小时及2周处死动物，取肾脏及血液标本进行检测;
　　肾脏组织切片行HE染色以评估肾脏损伤形态学变化并进行评分;应用DCFH-DA法检测肾脏组织内活性氧(reactive oxygen species，ROS)浓度;应用检测肾脏组织内丙二醛(Malondialdehyde，MDA)浓度来评估脂质过氧化程度;应用8-OHdG免疫组织化学染色评估肾脏组织内核酸受活性氧损伤情况;应用Oxyblot法检测肾脏组织内蛋白质受活性氧损伤情况;应用TUNNEL染色法评估肾脏组织内细胞凋亡情况，同时应用Ki67免疫组织化学染色评估肾脏组织内细胞增殖情况;肾脏组织内NOX2表达情况应用Western-blot和免疫组织化学染色法进行评估;
　　为评估受损肾脏功能和肾脏纤维化程度，将动物再灌注后第十二天切除右侧肾脏，2周时处死前抽取下腔静脉血检测尿素氮(BUN)和肌酐(Scr)浓度;获取肾脏组织进行Masson's三色染色以及α-SMA的表达检测;
　　体外实验，培养大鼠肾小管上皮细胞系NRK-52E和人脐带静脉血管内皮细胞HUVECs，以低氧损伤6小时后行MVs或M-199处理48小时，应用免疫细胞荧光染色和Western-blot法检测NOX2的表达。
　　结果:
　　体内实验中，经MVs治疗后IRI肾脏组织学损伤评分明显改善;再灌注后24小时和48小时在蛋白水平，核酸水平及膜脂质过氧化水平的氧化应激均得到减轻，肾脏组织内增殖细胞增多并且凋亡细胞减少，肾脏组织内NOX2蛋白表达水平下降并且肾脏组织内的活性氧水平降低;在再灌注后两周，肾脏经MVs治疗后纤维化水平下降，肾脏功能得到改善;
　　体外实验中经缺氧受损的NRK-52E和HUVEC的NOX2表达增高，经MVs处理后NOX2表达降低。
　　结论:
　　单次静脉应用人脐带间充质干细胞来源的MVs可以在缺血再灌注后早期保护肾脏，并且还可以在后期减轻肾脏纤维化以及改善肾脏功能;其机制可能是通过抑制NOX2的表达减轻肾脏组织内氧化应激水平。
　　第二部分间充质干细胞来源的微囊比条件培养基可能有更强的治疗作用:鼠类急性肾损伤模型的Meta分析
　　背景:
　　目前在间充质干细胞治疗各种原因引发的急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)的研究中，内分泌/旁分泌机制已经越来越受到重视;在本研究中，我们对关于间充质干细胞的条件培养基(conditioned medium，CM)或者间充质干细胞产生的细胞外微囊(extracellular-vesicles，Evs)对各种原因引发的鼠类（大鼠及小鼠）急性肾损伤的治疗作用的文献做了系统性综述，以肌酐为指标做了相关的Meta分析。
　　方法:
　　应用我们既定的检索策略，在PubMed和Scopus数据库检索相关文献，根据既定排除标准进行筛选得到相关文献;提取文献中相关信息，包括基线血清肌酐值、治疗前后血清肌酐值、是条件培养基或者微囊治疗、治疗途径(deliveryrout)、治疗时间(therapeutic time point)、肌酐测量时间(measurement time point)、急性肾损伤的模型以及其他相关的参数等;对治疗前后的肌酐差值行汇总分析(pooled analysis)，根据不同处理行亚组分析（sub-group analysis）和多变量Meta回归分析(multivariable Meta-regression analysis)，同时对于异质性的来源和发表偏倚也做了探讨。
　　结果:
　　通过文献检索和筛选，总共有13篇文献纳入本研究;汇总分析发现，在鼠类（大鼠或小鼠）的急性肾损伤模型中，经条件培养基/微囊治疗后血清肌酐值下降(0.93[1.20，0.67]， mg/dL);经过亚组分析发现，微囊比条件培养基具有更强的治疗作用(P=0.05);其他可影响治疗治疗后肌酐下降值的重要因素包括肌酐测量时间(P=0.0004)以及治疗时间点(P＜0.0001);而其他因素如治疗途径、急性肾损伤的模型、细胞类型等皆不是影响治疗效果的重要因素(P＞0.05);此外，多元Meta回归分析表明，测量时间点(P=0.041)，治疗时间点(P=0.03)，Ev值或CM(P=0.0003)和细胞类型(P＜0.0001)是异质性的起源。
　　结论:
　　本研究通过Meta分析证实，间充质干细胞来源的微囊或者条件培养基对急性肾损伤诱发的肾功能损害有治疗作用;与条件培养基相比较，微囊对急性肾损伤具有更明显的治疗作用;此外，在应用条件培养基或微囊治疗急性肾损伤时，较早的干预可能会取得相对较好的治疗效果。