脯氨酰寡肽酶过表达对硫代乙酰胺诱导大鼠肝纤维化模型影响

摘要

目的：探讨慢病毒介导的脯氨酰寡肽酶（POP）过表达对硫代乙酰胺诱导的大鼠肝纤维化模型的影响。
　　方法：从基因库中获取大鼠POP基因序列（NM_031324），构建携带POP基因慢病毒过表达载体，通过酶切鉴定及测序的方式鉴定阳性质粒，采用Western Blot的方法验证 POP蛋白在293T细胞内的表达；以不同剂量的POP慢病毒载体（1.25×10^7TU、2.5×10^7TU和5×10^7TU）转染正常大鼠，另设相应浓度空病毒载体对照（每组n=3，门静脉注射病毒)，注射后2 w进行肝脏取材，实时定量PCR检测不同剂量慢病毒转染后肝内POP mRNA相对表达量的差异；以慢病毒（5×10^7TU）转染正常大鼠，分别于注射后1 w、2 w和3 w处死大鼠，用实时定量 PCR检测转染不同时长肝内POP mRNA相对表达量变化。
　　40只雄性SD大鼠随机分为4组，采用5％TAA腹腔内注射诱导大鼠肝纤维化模型，各组分别在造模第1w末门静脉注射生理盐水（正常对照组和TAA模型组）、空病毒（空病毒组，TAA模型+空病毒组）或携POP慢病毒（POP慢病毒组，TAA模型+POP慢病毒）；在造模第4w末，隔夜禁食后次日下腔静脉取血，处死动物，称量肝脏湿重，留取肝脏组织；采用苏木素-伊红（HE）染色及Masson染色观察肝脏病理形态学及纤维化情况，采用化学比色法测定肝组织内羟脯氨酸含量，采用实时定量PCR检测肝脏组织POP、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、α平滑肌骨动蛋白（α-SMA）、转化生长因子β（TGF-β）和Ⅰ型胶原（Co l-1）mRNA表达，采用Western Blot法检测POP、CD68、α-SMA、TGF-β、磷酸化Smad-2蛋白表达水平，采用免疫组织化学染色检测 CD68(+)细胞数量和分布；采用自动生化仪测定各组大鼠血清生化指标，包括丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、血清白蛋白（ALB）、总胆红素（TBIL）。
　　结果：酶切鉴定及测序结果均与目的基因吻合，转染293T细胞后，Western Blot可在293T细胞内检测到Flag与目的基因融合蛋白；不同剂量的携POP慢病毒或空病毒转染大鼠2w后，与正常对照组比较，大鼠肝组织内POP mRNA表达在1.25×10^7TU慢病毒组RQ值为0.96，与对照组相比无显著差异，2.5×10^7TU慢病毒载体组与5×10^7TU慢病毒载体组RQ值分别为1.38和1.3，均显著高于对照组（P<0.01）,但2.5×10^7TU组与5×10^7TU组之间无统计学差异；空病毒载体与正常对照组间POP mRNA无显著差异。冰冻切片观察荧光与上述结果相符。
　　模型组POP蛋白相对表达量较正常对照组显著降低（P<0.05），而POP慢病毒组POP蛋白水平较其余三组均显著升高(P<0.01)，POP mRNA相对表达变化与POP蛋白相一致；TAA模型组和空病毒组的纤维化评分多为Ⅱ级，肝纤维化半定量积分分别为(15.2±1.69)和（15.3±4.62），显著高于正常对照组(1.75土0.63)和POP慢病毒组(7.75±2.71)（P<0.05）；模型组和空病毒组肝组织羟脯氨酸含量分别为（504.47±111.15）μg/g肝质量和（498.32±90.87）μg/g肝质量，均显著高于正常对照组【（298.20±47.47μg/g肝质量），P<0.05】，而POP慢病毒组大鼠肝组织中羟脯氨酸含量为（383.52±43.49μg/g肝质量），显著低于模型组和空病毒组（P<0.05）；模型组及空病毒组α-SMA mRNA较正常对照组分别升高2~3倍（P<0.01），蛋白水升高3~4倍（P<0.01），POP慢病毒组大鼠肝组织α-SMA mRNA和蛋白水平较模型组及空病毒组分别降低50%左右和30%~40%（P<0.05）；与对照组比较，模型组及空病毒组血清 AST【(167.21±41.41)U/L，(169.22±31.46) U/L】为对照组的1.4倍【(123.81±23.02) U/L，P均<0.05】，模型组及空病毒组的血清ALT【(62.79±10.80) U/L，(59.8±15.85) U/L】、TBIL【（167.21±41.41）μmol/L，（169.22±31.46）μmo l/L】为对照组的1.7～3.4倍【（33.67±2.84）μmo l/L，（2.56±1.17）μmo l/L，P均<0.01】，ALB【（20.54±2.02）g/L，（20.19±2.00）g/L】较对照组下降约20%【（25.01±1.77）g/L，P<0.01】；POP慢病毒组AST、ALT和TBIL分别为(127.89±32.7)U/L、(41.95±11.75)U/L和TBI(4.28±1.67)μmol/L，较模型组及空病毒组降低约30%~70%（P<0.05），ALB为(22.73±1.77)g/L，较正常对照组稍下降（P<0.05）；模型组及空病毒组较正常对照组 MCP-1 mRNA水平均升高4~5倍（P<0.01），POP慢病毒组大鼠肝组织MCP-1 mRNA水平较模型组及空病毒组降低50%~60%（P<0.05）；模型组及空病毒组较正常对照组TGF-β mRNA升高6~8倍（P<0.01），蛋白水平均升高1~2倍（P<0.01），POP 慢病毒组大鼠肝组织TGF-βmRNA较模型组及空病毒组降低40%~50%，蛋白水平降低40%（P<0.05）；模型组及空病毒组较正常对照组Smad2/3蛋白水平均升高1~2倍（P<0.01），POP慢病毒组大鼠肝组织Smad2/3蛋白水平较模型组及空病毒组降低40%~50%（P<0.05）；模型组CD68阳性细胞数为（52.75±21.639）/HP，空病毒组为（54±1.19.5）/HP，均显著高于正常对照组【（2.66±1.15），P<0.01】，而POP慢病毒组为（21±13.45）/HP，较模型组及空病毒组均显著减少（P<0.01）。
　　结论：构建成功的携POP基因慢病毒能成功在大鼠肝脏内实现POP蛋白的持续过表达；POP肝内过表达能抑制TAA诱导的大鼠肝纤维化的进展，这一过程中伴随着肝内MCP-1等炎症反因细胞因子表达抑制和CD68阳性细胞数量下调，以及促纤维化的TGF-β-1-磷酸化Smads2/3信号通路抑制。

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中英文缩略语

绪论

第一部分慢病毒POP表达栽体的构建及其在大鼠肝内转染效率研究

1.1材料与方法

1.1.1 材料

1.1.2 方法

1.2结果

1.2.1 慢病毒POP表达栽体构建、筛选及体外验证

1.2.2 硫代乙酰胺诱导大鼠肝纤维化模型的建立

1.2.3不同剂量的携POP慢病毒过表达载体或空病毒栽体转染大鼠的比较

1.2.4 同一剂量慢病毒载体转染大鼠肝脏的不同持续时间的比较

1.3讨论

第二部分慢病毒介导的脯氨酰寡肽酶过表达对硫代乙酰胺诱导大鼠肝纤维化影响

2.1材料与方法

2.1.1 材料

2.1.2 方法

2.2结果

2.2.1 携POP慢病毒过表达载体体内过表达成功

2.2.2 大鼠肝脏病理学变化

2.2.3 血清学分析

2.2.4 肝脏纤维化指标变化

2.2.5 肝脏内炎性指标的变化

2.2.6 TGF-β/Smad通路的变化

2.3讨论

2.3.1 脯氨酰寡肽酶与肝纤维化

2.3.2 脯氨酰寡肽酶与炎症反应

2.3.3 脯氨酰寡肽酶与TGF-β/Smad信号通路

结论

参考文献

附录 综述: AcSDKP对器官产纤维细胞功能的影响

致谢

攻读学位期间发表的学术论文和题目