利用重组大肠杆菌进行高分子量蜘蛛牵引丝蛋白2高效生产的研究

摘要

蜘蛛牵引丝由大壶状腺分泌形成，拥有卓越的力学性能；是一种在工业及生物医药方面极具应用前景的生物材料。天然蜘蛛牵引丝主要由两种高分子量蛋白构成，蜘蛛牵引丝蛋白1和2（major ampullate spidroin1 and2），文献信息表明前者对蜘蛛牵引丝的刚性性能起重要作用，后者主要负责弹性性能。由于蜘蛛攻击性强的天性，通过大规模养殖技术很难获得大量蜘蛛牵引丝。随着合成生物学技术的发展，异源生产蜘蛛牵引丝蛋白的方式受到越来越多研究者的关注。但是由于该蛋白分子量大、序列高度重复且甘氨酸含量高的特点，目前其产量普遍较低；并且关于蜘蛛牵引丝蛋白2的表达研究较少。本文根据大肠杆菌密码子偏好性对蜘蛛牵引丝蛋白2的核心重复片段进行基因设计，并在大肠杆菌中实现了不同分子量重组蜘蛛牵引丝蛋白2的表达载体构建和表达。通过将蛋白诱导温度由30℃降低到16℃，显著提高了分子量从28.3-256.5 kDa的重组蜘蛛牵引丝蛋白2的表达水平；而改变诱导剂浓度、诱导时机和培养基成分并没有显著提高该蛋白的表达量。通过对蛋白表达过程中质粒的维持性进行研究，发现可能是由于低温诱导条件下重组菌的质粒维持性提高使得目标蛋白的表达水平得到了显著提升。低温诱导策略对于高分子量蜘蛛牵引丝蛋白1表达水平的提高也有显著效果。实验中以代谢改造工程菌（含有能够提高胞内glycyl-tRNA含量的质粒）为宿主细胞进行低温诱导表达，进一步提高了分子量为201.6 kDa重组蜘蛛牵引丝蛋白2的产量。随后在3.0 L反应器中将低温诱导策略与高密度发酵技术相结合，表达生产分子量为201.6 kDa重组蜘蛛牵引丝蛋白2，获得3.6 g l-1的产量，也是迄今为止关于重组蜘蛛牵引丝蛋白2生产水平最高的报道。后期通过对发酵后菌体蛋白进行硫酸铵逐级沉淀，对目标蛋白的分离纯化进行初步探索。本研究所提出的低温诱导与高密度发酵结合的方法简单方便且效果显著；为今后大规模生产蜘蛛丝蛋白提供了一定的借鉴。

目录

声明

第一章 绪论

1.1蜘蛛丝

1.2重组蜘蛛丝蛋白表达的研究现状

1.3立题目的与意义

1.4本文的主要研究内容

第二章 MaSp2表达质粒及其重组大肠杆菌的构建

2.1前言

2.2材料与方法

2.3实验结果与讨论

2.4本章小结

第三章 重组MaSp2的低温诱导表达

3.1前言

3.2材料与方法

3.3实验结果与讨论

3.4本章小结

第四章 MaSp2-64聚体重组大肠杆菌的反应器实验

4.1前言

4.2材料与方法

4.3结果与讨论

4.4本章小结

第五章 结论与展望

5.1全文结论

5.2本文创新点

5.3研究展望

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间已发表或录用的论文