长链非编码RNA XR007793在高张应变诱导血管平滑肌细胞增殖中的作用

摘要

血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）异常增殖与心血管疾病发生和发展过程密切相关。在高血压等心血管疾病中，由于血流脉动而产生的周期性张应变（cyclic strain）异常增高是诱导 VSMCs异常增殖的重要因素。周期性张应变可激活 VSMCs表面的多种力学感受器，机械刺激信号被转化为生物学信号传导进细胞内，激活不同信号通路，调控基因表达，影响细胞功能。但其力学生物学机制尚未完全阐明。
　　在血管力学生物学领域，较多的研究关注蛋白编码基因（protein-coding genes）以及短链非编码RNA（如miRNA等），而忽略了长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）在应力信号转导和血管重建中的作用。本研究旨在通过高通量基因芯片技术筛选与VSMCs增殖活性变化相关的lncRNA分子，在静态以及病理性高张应变条件下干扰lncRNA表达，从功能缺失角度（loss of function）明确lncRNA对VSMCs增殖活性变化的影响，并探讨该过程中可能的分子信号机制。
　　首先，本文应用高通量基因芯片构建自发性高血压大鼠（spontaneously hypertensive rats，SHR）和正常血压对照大鼠（wistar kyoto rats，WKY）lncRNA和mRNA差异表达谱，结合芯片差异表达倍数、长度特征和lncRNA-mRNA共表达网络(coding-non-coding co-expression network，CNC网络)，经生物信息学聚类分析及IPA（ingenuity pathway analysis）软件分析筛选出lncRNA XR007793和可能的共表达分子,包括信号转导与转录激活因子2（signal transducer and activator of transcription2，Stat2），细胞分裂周期相关基因8（cell division cycle associated8，Cdca8），LIM同源蛋白2（LIM domain only2，lmo2），干扰素调节因子7（interferon regulatory factor7，Irf7）。其次，我们在静态条件下干扰XR007793表达，观察VSMCs增殖活性及Stat2、Cdca8、lmo2、Irf7的表达变化。之后，应用体外周期性张应变加载系统Flexcell-4000对VSMCs施加不同幅度的张应变刺激。本研究中，5%牵拉幅度代表生理条件下VSMCs所受张应变刺激，15%牵拉幅度代表高血压病理条件下 VSMCs所受张应变刺激，探讨病理性高张应变对VSMCs增殖活性和XR007793表达变化的影响，并结合RNA干扰实验，进一步探讨XR007793在病理性高张应变调控 VSMCs增殖中的作用，并对XR007793可能影响的下游信号分子进行了研究。
　　芯片结果显示，同WKY相比，SHR中共有235个差异表达lncRNA，其中68个lncRNA上调，167个lncRNA下调。SHR中有527个差异表达mRNA，其中255个 mRNA上调，272个mRNA下调。经生物信息学聚类分析和IPA软件分析，我们选取差异表达lncRNA XR007793作为后续研究分子。体外检测结果显示，静态条件下干扰XR007793，VSMCs增殖水平显著下降。同时，我们还发现Stat2、Lmo2、Irf7的mRNA表达水平均发生显著下调，利用Western blot检测STAT2蛋白表达变化发现干扰XR007793能显著下调STAT2的表达水平，提示其可能参与了静态条件下 XR007793调控的VSMCs增殖活性变化过程。在病理性高张应变条件下，我们发现，VSMCs增殖活性显著上升，XR007793的表达水平也发生显著变化。相较5%生理性张应变，VSMCs受到病理性高张应变刺激3 h，6 h后，XR007793表达水平显著上升，12 h无显著性变化，24 h显著下降，表明XR007793受周期性张应变调控，提示其在高周期性张应变诱导的VSMCs增殖活性变化中可能发挥重要作用。在病理性高张应变条件下干扰XR007793，VSMCs增殖水平显著上升，Cdca8的mRNA表达水平显著上调，表明XR007793可能通过Cdca8参与了病理性高张应变调控的VSMCs增殖活性变化过程。
　　综上所述，自发性高血压大鼠与对照正常血压大鼠胸主动脉VSMCs中lncRNA和 mRNA表达谱存在差异。生物信息学分析提示的差异表达 lncRNA XR007793与 VSMCs增殖活性变化密切相关，其在静态条件下可能通过调控Stat2、Lmo2、Irf7的表达参与VSMCs增殖活性变化过程，在高张应变条件下可能通过调控Cdca8的表达诱导VSMCs增殖活性变化。以上研究结果揭示了lncRNA在应力信号转导网络中的重要作用，丰富了高血压条件下血管重建的力学生物学机制研究，并为寻找新的高血压药物治疗靶标提供了思路。

目录

声明

英文缩略语

1 绪论

1.1 周期性张应变与血管重建

1.2 lncRNA 概述

1.3 lncRNA的生物学功能

1.4 本研究的主要内容和意义

2 实验仪器和材料

2.1 实验仪器

2.2 试剂和材料

2.3 主要溶液成分及配制

3 实验方法

3.1 大鼠无创尾动脉压测量

3.2 芯片样品制备、标记、杂交、扫描和数据获取

3.3 CNC网络构建

3.4 实时荧光定量PCR（real time RT-PCR)

3.5 周期性张应变加载

3.6 RNA干扰实验

3.7 Brdu检测细胞增殖

3.8 WST-1检测细胞代谢活性

3.9 统计学方法

3.10其它实验方法

4 结果

4.1 lncRNA高通量芯片结果

4.2 原代培养VSMCs鉴定

4.3静态条件下，XR007793参与VSMCs增殖活性变化过程

4.4 XR007793参与高张应变条件下VSMCs增殖活性变化过程

5 讨论

5.1 体外模拟张应变加载

5.2 VSMCs增殖活性检测方法

5.3 lncRNA参与VSMCs增殖活性变化过程

5.4 总结和展望

全文小结

参考文献

附录1

附录2

附录3

致谢

攻读硕士学位期间已完成和发表的学术论文