牙髓干细胞复合微纳结构HA修复牙槽骨缺损的实验研究

摘要

目的：
　　本研究的目的在于探讨表面微纳结构形貌修饰的轻基磷灰石（micro-nano structured hydroxyapatite，m n H A)生物陶瓷复合牙髓干细胞（dental pulp stem cells，DPSCs)修复牙槽骨缺损的效果。首先，分离培养牙髓干细胞并探讨其干细胞特性及成骨向分化能力；其次，体外研究mnHA对 DPSCs的生物学作用；最后，在大鼠牙槽骨缺损动物模型中探讨mnHA复合DPSCs的体内成骨效果。
　　材料和方法：
　　1.采用改良组织块法原代培养人牙髓细胞，免疫磁珠法分选Stro-l+人牙髓干细胞。通过CCK8检测人DPSCs的增殖活性；免疫荧光染色检测细胞表面波形丝蛋白（Vimentin)、细胞角蛋白（cytokeratin，C K)、S-100和 Stro-1的表达;流式细胞术检测其干细胞表面特征性标志物CD29、CD44、CD90、CD105、CD34、CD45的表达。
　　2.体外诱导人DPSCs成脂向分化，油红染色观察成脂诱导后脂滴的形成情况。成骨诱导液诱导人D P S C s向成骨细胞分化，通过碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，A L P)染色观察成骨诱导后细胞的成骨活性；茜素红染色观察矿化结节形成情况；Real-time P C R检测成骨相关基因A L P、I型胶原（collagen I，Col I)、runt相关转录因子2(runt-related transcription factor2，Runx2)和骨妈素（osteocalcin，O C N) m R N A的表达。
　　3.体外分离培养大鼠DPSCs后分别接种到mnHA生物陶瓷和表面光滑致密的传统 H A生物陶瓷上。通过细胞骨架蛋白染色、扫描电镜（scanning electron microscope，S E M)、M T T、A L P染色和活性检测以及 Real-time P C R检测mnHA生物陶瓷对DPSCs的粘附、增殖以及促进成骨/成血管相关因子表达的作用。
　　4.建立大鼠牙槽骨缺损动物模型并植入材料进行修复。实验分为五组：（1)传统表面光滑致密的H A生物陶瓷（HA)；(2)表面微纳结构形貌修饰HA生物陶瓷（mnHA)；(3)传统表面光滑致密的H A生物陶瓷复合大鼠DPSCs(HA+DPSCs)；(4)表面微纳结构形貌修饰H A生物陶瓷复合大鼠DPSCs(mnHA+DPSCs)；(5)空白对照组（Control)。通过 Micro-CT、四环素/茜素红/钙黄绿素三色序列荧光染色以及组织学观察并检测新骨的形成和矿化情况。
　　结果：
　　1.通过改良组织块结合免疫磁珠法成功分离并纯化人DPSCs。人 D P S C s形态多呈长梭形，具有较强的增殖能力，表达间充质干细胞表面标志物CD44、CD90、CD105、CD29和 Stro-1，而造血干细胞表面标志物CD34和 CD45阴性表达。
　　2.人 DPSCs成脂向诱导后，油红染色可见脂滴形成。成骨向诱导后，人D P S C s具有较强的成骨向分化潜能。在成骨诱导过程中，人 DPSCs A L P染色呈阳性，同时 ALP m R N A表达水平升高；成骨相关基因Col I和 Runx2 mRNA的表达呈先升高后下降的趋势；而 OCN mRNA的表达随着时间的推移呈不断升高的趋势；诱导21天茜素红染色可见矿化结节形成。
　　3.与传统表面光滑致密的H A生物陶瓷相比，表面微纳结构形貌修饰的H A生物陶瓷可明显促进大鼠DPSCs的早期粘附、增殖、成骨向分化以及血管生长因子的表达，A L P活性明显增加，成骨相关基因Runx2、O C N、牙本质涎磷蛋白（dentin sialophosphoprotein，D S P P)和牙本质基质蛋白1（dentin matrix protein-1，DMP-1)以及成血管相关基因血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF)和血管生成素-1（angiopoietin-1，Ang-1) mRNA的表达增高。
　　4.大鼠牙槽骨缺损修复体内实验发现，材料修复组骨体积和组织体积的比值(bone volume relative to tissue volume，B V/T V)、骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb. T h)、骨小梁数量(trabecular number，Tb. N)、序列焚光染色和新骨形成量均高于空白对照组。其中m n H A组 BV/TV、Tb. Th、Tb. N、序列荧光染色和新骨形成较H A组高，而 mnHA生物陶瓷复合DPSCs后可进一步增强其在体内的成骨效果。
　　结论：
　　1.通过改良组织块联合免疫磁珠分选法可成功培养并获得纯度较高的人DPSCs,所获得的细胞具备了间充质来源干细胞的生物学表型和特性，具有较强的成骨向分化潜能，在成骨、成脂诱导液作用下可分化为成骨细胞和脂肪细胞。
　　2.与传统表面致密光滑的H A生物陶瓷相比较，表面微纳结构形貌修饰的HA生物陶瓷具有促进DPSCs早期粘附、增殖、成骨向分化和成血管相关因子表达的作用，这种作用可能与其微米棒/纳米棒组合结构的表面形貌接近于正常骨组织结构密切相关。
　　3.在大鼠牙槽骨缺损动物模型中，m nH A生物陶瓷复合大鼠DPSCs可以在体内明显促进新骨形成和矿化，mnHA陶瓷材料可以作为潜在的仿生生物活性材料用于牙槽骨修复。

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