探讨多模态影像技术评价NAFLD初步研究

摘要

目的：探讨多模态影像技术量化诊断非酒精脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)诊断效能。
　　方法：①40只雄性SD大鼠随机分2组，对照组10只，喂标准鼠料，高脂组30只，喂高脂饲料。对照组于第4周和第10周各对5只大鼠、高脂组于第4，6，8，10，12和16周分别对5只大鼠进行常规超声，声触诊组织定量(Virtual Touch tissue quantification，VTQ）技术、CT和1HMRS扫查。常规超声半定量判断脂肪肝程度，超声VTQ技术检测肝脏剪切波速度(shear wave velocity，SWV)值，CT扫查测量肝脏和腰大肌CT值，计算肝腰大肌密度比；1HMRS扫查检测肝内脂肪含量（intrahepatic contant of lipid，IHCL）。完成所有影像检查后检测谷草转氨酶(Aspartate aminotransferase，AST)、谷丙转氨酶(Alanine aminotransferase，ALT)、胆固醇(Total cholesterol，TC)和甘油三酯（triglycerides，TG）。最后处死大鼠，取肝脏组织块 HE染色行组织学分析，依据 Brunt's组织学诊断。②参照中国肥胖问题工作组（WGOC）推荐的“中国学龄儿童青少年超重、肥胖体重指数值分类标准”和2006年NAFLD诊疗指南推荐的诊断标准，将100例肥胖儿童分为：非NAFLD组，单纯性脂肪肝（nonalcoholic simple fatty liver，NAFL）组和非酒精脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH）组，设立24例正常儿童为对照组，检测所有入选者形体学参数、生化检查、肝脏常规超声和VTQ扫查。应用SPSS19.0和 MedCalc for Windows，version15.10统计分析软件。
　　结果：①高脂饮食诱发的NAFLD大鼠模型造模方法简单，成模率高，但存在造模时间长的缺点；②常规超声诊断脂肪肝程度的准确率欠佳；③超声VTQ技术，CT和1H MRS技术诊断重度脂肪肝和NASH均具有较好的诊断效能，而应用VTQ技术诊断轻中度脂肪肝的诊断效能不如CT，本实验中1H MRS扫查成功率低、耗时；④VTQ技术评价肥胖儿童NASH的诊断效能较高。
　　结论：超声VTQ技术诊断重度脂肪肝和NASH的诊断效能与CT扫查相近；超声VTQ技术有助于临床诊断肥胖儿童NASH，具有一定的临床指导意义。
　　前言：
　　肝脏是人体摄取、转运、代谢及排泄脂质的主要器官，其中的任何一个环节发生异常均可导致肝实质细胞内甘油三酯蓄积。当光镜下单位面积的脂肪变肝细胞超过5%以上或肝内脂肪含量蓄积超过肝湿重的5%~10%时形成脂肪肝。肝小叶是脂肪肝病变的主体，随着脂质在肝细胞内量的蓄积增加和持续时间延长，肝细胞发生坏死、气球样变、Mallory小体、炎症反应和肝纤维化。因此，NAFLD包括NAFL，NASH和非酒精脂肪性肝硬化三个类型。肝脏组织学检查是非酒精肝脂肪变、非酒精脂肪性肝炎和非酒精脂肪性肝纤维化分级分期诊断金标准，但其存在标本取样误差及检查方法有创性等不足。常规超声、CT和MRI是目前用于诊断脂肪肝的主要的影像学诊断方法，但各自存在一定程度缺陷。
　　组织的弹性(或硬度)与其生物学特性紧密相关，即组织器官发生病理改变后，组织器官内的组织成分和结构相应发生改变，其弹性特征亦会随之而改变。VTQ技术利用超声探头发射短时程、高能量的聚焦脉冲推力激励组织，组织受力后在与聚焦脉冲推力平行的方向（纵向）发生位移，并在与其垂直（横向）的方向产生剪切波，获取组织内感兴趣区的剪切波并测量剪切波速度值，随后通过公式计算可获得生物组织的弹性模量，从而判断组织弹性（硬度）。目前应用VTQ技术分期诊断肝纤维化已获得较为肯定的结果，但肝纤维化已经无法逆转，导致临床干预治疗后的疗效欠佳。NASH是在肝细胞脂肪变的基础上发生肝细胞坏死（主要表现为肝细胞气球样变）、Mallory小体、炎症细胞浸润和肝纤维化，肝纤维化不是诊断NASH的必备组成条件。伴或不伴肝纤维化NASH的病理组成及结构均已不同于NAFL，组织的弹性（硬度）亦相应发生改变，此为本研究应用超声弹性成像技术诊断NAFL和NASH的理论基础。本实验拟分别应用常规超声、超声VTQ技术、CT和1H MRS研究NAFLD大鼠，探讨多模态影像技术各自量化诊断NAFLD的诊断效能。
　　第一部分：建立NAFLD大鼠模型
　　目的：建立高脂肪饮食诱导的NAFLD动物模型。
　　方法：40只SD大鼠，雄性，50天龄，体重170-180g。适应性喂养1周后编号，随机分为2组：正常对照组10只，标准鼠料喂养；高脂组30只，高脂饲料喂养，两组大鼠均自由进水。高脂饲料为45%脂肪肝动物饲料，饲料原料组成如下：繁殖鼠料，猪油，胆固醇，胆盐，蔗糖，酪蛋白，麦芽糖精和预混料；饲料能量组成如下：脂肪45%；粗蛋白18%，碳水化合物37%。正常对照组分别于第4周和第10周随机抽取5只大鼠，高脂组分别于第4周，6，8，10，12和16周随机抽取5只大鼠心脏取血，检验AST、ALT、TC和TG。实验结束处死动物肝脏称重，计算肝脏指数(HI)=肝脏湿重(LW)/动物体重(BW)x100%。完成全部影像检查后，空气栓塞处死实验动物，取与影像学检查位置基本相同的肝脏组织块，常规苏木素伊红（Hematoxylin Eosin，HE）染色行病理分析，根据Brunt's组织学标准诊断。
　　结果：①40只大鼠均成功完成实验，成模率为100%(40/40)；②依据 Brunt's组织学标准诊断肝脏脂肪变程度：40只大鼠中正常肝脏组（F0，9只），轻度脂肪肝组（F1，11只），中度脂肪肝组（F2，8只），重度脂肪肝组（F3，12只）；依据脂肪性肝炎诊断标准：40只大鼠中正常肝脏组9只，NAFL组19只，NASH组12只，所有大鼠（40只）均未出现肝纤维化的组织学改变；③ TC，TG，ALT，AST在重度脂肪肝组显著高于正常肝脏组、轻度和中度脂肪肝组(P<0.05)；④肝脏湿重和肝脏指数在中度和重度脂肪肝组显著高于正常肝脏组和轻度脂肪肝组(P<0.05)。
　　结论：超营养诱发的NAFLD大鼠模型造模方法简单、成本低、死亡率低，成模率高，其病理和病理生理变化变化符合NAFLD的发病特点和病程进展，是研究NAFLD的理想模型，但该模型存在造模时间长的缺点，有待进一步的研究改良造模方法，寻求更为理想的研究NAFLD动物模型。
　　第二部分：声触诊组织量化技术评价NAFLD大鼠实验研究
　　目的：探讨VTQ技术量化诊断NAFLD大鼠的诊断效能。
　　方法：40只雄性 SD大鼠随机分2组，对照组10只，喂标准鼠料，高脂组30只，喂高脂饲料。对照组于第4周和第10周各对5只大鼠、高脂组于第4，6，8，10，12和16周分别对5只大鼠进行常规超声和VTQ扫查。VTQ扫查使用Siemens ACUSOA2000彩色多普勒超声诊断仪，9L4线阵探头。常规扫查观察肝脏、肾皮质回声强度，包膜、横隔及肝内血管显示清晰程度，根据非酒精脂肪性肝病诊疗指南分级诊断脂肪肝程度。随后在二维图像观察的基础上，将 ROI置于大鼠肝脏右叶的位置，距体表约1-1.5cm处，ROI大小5 mm×5mm，启动VTQ技术，测量SWV值，重复操作3次，计算SWV的平均值并用于分析。完成所有影像检查后处死大鼠，取肝脏组织块 HE染色行组织学分析，依据 Brunt's组织学诊断标准作出诊断。应用SPSS19.0和 MedCalc for Windows，version15.10统计分析软件。
　　结果：①依据肝脏组织学检测结果，肝脏常规超声扫查诊断准确率为55%（22/40），低估了42.5%（17/40）大鼠的脂肪肝程度诊断，高估了2.5%（1/40）大鼠的脂肪肝程度诊断；②正常肝脏组、轻度脂肪肝组，中度脂肪肝组和重度脂肪肝组SWV分别为1.02±0.12m/s，1.12±0.10m/s，1.21±0.07m/s和1.46±0.16m/s，SWV在重度脂肪肝组高于正常肝脏组、轻度和中度脂肪肝组（P<0.05)，以SWV构建诊断重度脂肪肝（F3)的ROC曲线下面积（Az值）为0.993，对应的SWV界值为1.27 m/s，敏感性为100%，特异性为92.9%；③正常肝脏组，NAFL组和NASH组的SWV值分别为1.02±0.12m/s，1.16±0.10m/s和1.46±0.16m/s，SWV值在3组间有显著差异，以SWV构建诊断NASH的ROC曲线的Az值为0.993，对应的SWV界值为1.27m/s，敏感性为100%，特异性为92.9%；④ SWV与肝脏脂肪变程度和NASH呈显著正相关，相关系数分别为0.863和0.833（P<0.05）。
　　结论：应用超声 VTQ技术检测 NAFLD大鼠肝脏组织硬度诊断重度脂肪肝和NASH的诊断效能高，优于常规超声。
　　第三部分：CT评价NAFLD大鼠实验研究
　　目的：评价CT量化诊断NAFLD的诊断效能。
　　方法：40只雄性 SD大鼠随机分2组，对照组10只，喂标准鼠料，高脂组30只，喂高脂饲料。对照组于第4周和第10周各对5只大鼠、高脂组于第4,6,8,10,12，16周分别对5只大鼠进行 CT扫查。CT扫查使用Siemens公司 Somaton definition型CT扫描机，纱带加压固定腹部抑制其呼吸运动。扫描参数：管电压120kV，管电流50mA，层厚：2.4mm，扫描时间2.0s，CT扫查范围为自膈顶至盆腔。扫查前先利用水模进行严格的调零处理，以标化 CT测量值。测量肝脏CT值的ROI置于肝右叶，ROI大小10mmx10mm。测量右侧腰大肌CT值的ROI大小同为10mmx10mm，分别测量肝CT值(Liver CT value)和腰大肌CT值(Psoas CT value)。重复测量3次，取3次测值的平均值，计算肝腰大肌密度比(1iver-Psoas density ratio)。完成所有影像检查后处死大鼠，取肝脏组织块 HE染色后行组织学分析，依据Brunt's组织学标准诊断。应用SPSS19.0和 MedCalc for Windows，version15.10统计分析软件。
　　结果：①正常肝脏组，轻度脂肪肝组，中度脂肪肝组和重度脂肪肝组肝CT值分别为71±3.3HU，45±11HU，29±11HU和17±9HU；肝腰大肌密度比分别为1.00±0.04，0.67±0.14，0.43±0.17和0.26±0.13，组间两两比较差异显著（P<0.05)；②以肝脏CT值和肝腰大肌密度比构建诊断≥轻度脂肪肝(F1)，ROC曲线Az值分别为1和0.998，诊断≥中度脂肪肝(F2) ROC曲线的Az值分别为0.965和0.956；诊断=重度脂肪肝(F3) ROC曲线的Az值为0.949和0.943；③正常肝脏组，NAFL组和NASH组的CT值分别为71±3.3HU，38±14HU和17±9HU；肝腰大肌密度比分别为1.00±0.04，0.57±0.20和0.27±0.13；④以肝脏CT值和肝腰大肌密度比构建诊断NASH的ROC曲线Az值分别为0.935和0.933；⑤SWV值，肝脏CT值和肝腰大肌密度比诊断=重度脂肪肝（F3）和NASH的ROC曲线下面积经Z检验，差异无统计意义，P>0.05；⑥肝脏CT值和肝腰大肌密度比与肝脂肪变程度呈显著负相关，相关系数分别为r=-0.908，r=-0.897；肝脏CT值和肝腰大肌密度比与NASH呈显著负相关，相关系数分别为r=-0.856，r=-0.854（P<0.05）。
　　结论：CT扫查和超声VTQ技术诊断重度脂肪肝和NASH的诊断效能相近，CT扫查诊断轻度和中度脂肪肝的诊断效能优于超声VTQ技术。
　　第四部分：1H MRS评价NAFLD大鼠实验研究
　　目的：评价1H MRS量化诊断NAFLD大鼠的诊断效能。
　　方法：40只SD大鼠，随机分2组，对照组10只，喂标准鼠料，高脂组30只，喂高脂饲料。对照组于第4周和第10周各对5只大鼠、高脂组于第4,6,8,10,12，16周分别对5只大鼠进行1H MRS扫查。GE Signa HDx3.0T超导型MR扫描仪，8通道头部线圈。扫描序列包括：MRI三平面定位扫描序列和肝脏单体素点波谱成像序列。先扫描定位图像，在轴面T2加权像（T2 weighted imaging，T2WI）选择 ROI。勾画 ROI时尽量避开周围大血管、胆管及肝脏边缘，设置饱和带避免周围脂肪、骨、气体的干扰；ROI大小为7mm×7mm×7mm。采用SAGE7.0软件进行后处理分析原始数据，1H MRS后处理包括：载入数据，选择通道，谱线重建(Spectrum reconstruction)，相位校正，自定义控件（zoom panel）选择施加压水脉冲或不施加压水脉冲，零填充(Zero filling)，时相调整(Phase correction)，手动选择脂峰和水峰后创建表格(Creating a peak and table)，测定ROI内水和TG的峰值和波峰下面积(Peak value and peak area)，最后根据公式计算获得肝内脂肪含量（intrahepatic contant of lipid，IHCL）。完成所有影像检查后处死大鼠并解剖观察肝脏，取与影像学检查位置基本相同的肝脏组织块，常规HE染色行组织学分析，根据Brunt's组织学标准诊断。
　　结果：①12只大鼠获得稳定的脂峰和水峰谱线，正常肝脏组、轻度脂肪肝组（F1）、中度脂肪组(F2)及重度脂肪肝组(F3)获得稳定的脂峰和水峰谱线的成功率分别为22.2%(2/9)、18.2%(2/11)、25%(2/8)和50%(6/12)；②正常肝脏组IHCL为0，重度脂肪肝组IHCL的均数为31.6%±10.8%；50%的重度脂肪肝组获得稳定的谱线，以IHCL构建诊断=重度脂肪肝(F3)的ROC曲线下面积为0.861，对应的IHCL界值为>20.85m/s%，敏感性为83.3%，特异性为83.3%，提示1H MRS诊断重度脂肪肝有较高的诊断效能。
　　结论：1H MRS诊断重度脂肪肝（F3）的诊断效能较好，但扫查耗时、步骤繁琐，后处理复杂，获得稳定的脂峰和水峰谱线困难，因此不宜作为NAFLD诊断和随访的首选影像学诊断手段。
　　第五部分：声触诊组织量化技术评价肥胖儿童NAFLD应用研究
　　目的：探讨VTQ技术量化诊断肥胖儿童NAFLD可行性。
　　方法：参照中国肥胖问题工作组（WGOC）推荐的“中国学龄儿童青少年超重、肥胖体重指数值分类标准”和2006年 NAFLD诊疗指南推荐的诊断标准，将2012～2015年间我院就诊的100例肥胖儿童分为：非NAFLD组43例（超声表现不符合脂肪肝及肝酶基本正常），平均年龄（10土2.4）岁，BMI25.3土3.4kg/m2；NAFLD组57例（除外饮酒、病毒性肝炎等其它可导致脂肪肝的疾病，超声表现符合脂肪肝诊断标准）。57例NAFLD肥胖儿童依据NAFL和NASH诊断标准分为：22例NAFL组（肝酶基本正常，超声表现符合脂肪肝诊断标准），平均年龄（10土2.9）岁，BMI26.9土3.2kg/m2；35例NASH组（存在代谢综合征或不明原因血清ALT水平升高，超声表现符合脂肪肝诊断标准），平均年龄（10土2.5）岁，BMI30.6土9.3kg/m2。随机选取24例与肥胖组年龄、身高、性别等相匹配的儿童作为正常对照组，平均年龄(9±1.7)岁，BMI19.1土2.2 kg/m2。所有入选者检测形体学参数、生化检查及肝脏常规超声和 VTQ检查。使用Siemens ACUSOA2000彩色多普勒超声诊断仪，自带VTQ技术成像软件，受检者平卧位，常规扫查肝脏，选择肝右前叶的扫查切面，感兴趣区距探头表面4～5cm，取样区避开肝内可见管道结构，所测值为 SWV值，单位为 m/s，测量3次取其平均值。应用SPSS19.0和 MedCalc for Windows，version15.10统计分析软件。
　　结果：①一般资料比较年龄、性别在各组间比较差异无统计学意义(P>0.05）；②NASH组BMI，BP、FBS，TG，TC及ALT高于NAFL组、非NAFLD组和对照组（P<0.01）；③对照组，非NAFLD组，NAFL组和NASH组的SWV值分别为1.06±0.04m/s，1.08±0.06m/s1.14±0.08m/s和1.60±0.26m/s，NASH组SWV值显著高于NAFL组、非NAFLD组和对照组（P<0.01）；④SWV与ALT与BMI呈显著正相关，相关系数为分别为0.511和0.391（P<0.01）；⑤以SWV构建诊断NASH的ROC曲线Az值为0.979，对应的SWV界值为>1.21m/s，敏感性为97.1%，特异性为96.6%。
　　结论：SWV有助于辅助临床医师结合病史和各项生化检查临床诊断肥胖儿童NAFL和NASH，提高NASH诊断准确率。

目录

符号说明

绪论

1. 非酒精脂肪性肝病

2. NAFLD的临床诊断方法

3.本研究的主要内容和意义

参考文献

第一部分建立NAFLD大鼠模型

材料和方法

结果

讨论

小结

参考文献

第二部分VTQ技术评价NAFLD大鼠实验研究

材料和方法

结果

讨论

小结

参考文献

第三部分双源CT评价NAFLD大鼠实验研究

材料和方法

结果

讨论

小结

参考文献

第四部分1H MRS评价NAFLD大鼠实验研究

材料和方法

结果

讨论

小结

参考文献

第五部分VTQ技术评价肥胖儿童NAFLD应用研究

材料和方法

结果

讨论

小结

参考文献

全文总结

第一部分 建立高脂饮食诱导的NAFLD大鼠模型研究

第二部分 多模态影像技术评价NAFLD大鼠实验研究

第二部分 声触诊组织量化技术评价肥胖儿童NAFLD应用研究

创新点及不足

附录

致谢

学术论文及科研成果

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