长链非编码RNA ODRUL调控骨肉瘤阿霉素耐药的机制研究

摘要

背景：骨肉瘤是儿童和青少年中最常见的原发性恶性骨肿瘤，化疗是其最重要的辅助疗法，然而阿霉素耐药的出现极大地阻碍了其治疗。长链非编码RNA在肿瘤发生、发展中发挥关键调控作用的报道已有很多。寻找与骨肉瘤阿霉素耐药相关的lncRNA可能有助于提高临床的化疗敏感性。
　　目的：为了从lncRNA的角度探索骨肉瘤阿霉素耐药的潜在机制并且深入讨论化疗耐药发生的原因及可能的克服骨肉瘤阿霉素耐药的潜在策略。
　　方法：采用第三代人类lncRNA-mRNA复合芯片在三组配对的阿霉素抵抗和敏感的骨肉瘤细胞(MG63/DXR和MG63)中筛选差异表达的lncRNA和mRNA，随机选择15个差异表达的lncRNA（5类）通过qRT-PCR法在细胞系中检测其芯片结果的一致性；通过qRT-PCR法在配对的MG63/DXR和MG63细胞及另一对配对的阿霉素抵抗和敏感的骨肉瘤细胞（KH-OS/DXR和KH-OS）、其它阿霉素敏感的骨肉瘤细胞（U-2 OS和Saos2）中检测差异表达倍数最大的3个lncRNA（2个上调倍数最大、1个下调倍数最大）的表达量；然后我们命名表达上调倍数最大的lncRNA-lncRNA ENST00000563280为骨肉瘤阿霉素耐药相关上调lncRNA，即lncRNA ODRUL，并在配对的60例骨肉瘤病人肿瘤组织中通过qRT-PCR的方法检测lncRNA ODRUL的表达量并与临床参数相结合探索其可能的临床意义； CCK-8实验检测，通过siRNA下调阿霉素抵抗的骨肉瘤细胞（MG63/DXR和KH-OS/DXR）中lncRNA ODRUL的表达后，骨肉瘤细胞对于阿霉素敏感性的变化；流式细胞术检测细胞周期和凋亡的改变；Transwell实验和划痕实验分别检测细胞侵袭和细胞迁移能力的改变；为进一步探讨lncRNA调控骨肉瘤阿霉素耐药的分子机制，行生物信息学分析lncRNA ODRUL与ABCB1、EGFR、ABCC3、IL-6等耐药相关基因的表达的相关性；通过siRNA下调阿霉素抵抗的骨肉瘤细胞（MG63/DXR和KH-OS/DXR）中lncRNA ODRUL的表达后，通过PCR和WB实验分别在RNA和蛋白质水平检测这些基因的表达变化。
　　结果：通过全基因组的lncRNA-mRNA表达谱分析，我们发现3465个lncRNA（其中1761个上调且1704个下调）和3278个mRNA（其中1607个上调且1671个下调）在三组配对的阿霉素抵抗的骨肉瘤细胞MG63/DXR和配对的阿霉素敏感的骨肉瘤细胞MG63中差异表达（差异倍数＞2，P<0.05且错误发现率（FDR）<0.05）；PCR验证随机选择的15个lncRNA的表达差异与芯片结果全部一致，这说明了芯片平台的可靠性；同时我们发现lncRNA ODRUL在阿霉素敏感和抵抗的骨肉瘤细胞系中表达趋势始终是一致的，即耐药株中表达量明显高于敏感株，在一定程度上说明了其稳定性和广泛性；除此之外，骨肉瘤化疗抵抗组肿瘤组织中lncRNA ODRUL的表达明显高于化疗敏感组，且早期肺转移组表达明显高于非早期肺转移组，同时高表达lncRNA ODRUL的骨肉瘤病人的生存率和生存时间明显低于低表达组；在MG63/DXR和KH-OS/DXR细胞中，通过siRNA下调lncRNA ODRUL的表达后，细胞对于阿霉素的敏感性均较对照组增强，G1期细胞比例增加，晚期凋亡细胞比例增加，同时细胞侵袭和迁移能力较对照组减弱；另外生物信息学分析（共表达分析）发现lncRNA ODRUL与ABCB1、EGFR、ABCC3、IL-6等耐药相关基因的表达的相关性均较高，相关系数在0.995以上或者-0.995以下；在MG63/DXR和KH-OS/DXR细胞中，通过siRNA下调lncRNA ODRUL的表达后，PCR和WB实验结果显示只有ABCB1的表达明显下调，其余基因的表达无明显变化，这提示lncRNA ODRUL可能是通过影响经典耐药相关基因ABCB1的表达来调控骨肉瘤细胞的化疗抵抗性的。
　　结论：在本次研究中，我们在配对的阿霉素抵抗的骨肉瘤细胞MG63/DXR和配对的阿霉素敏感的骨肉瘤细胞MG63中发现了众多差异表达的lncRNA和mRNA分子；并通过一系列的筛选策略确定了靶标lncRNA ODRUL，发现其在骨肉瘤阿霉素耐药的发生发展中发挥了重要的作用，提示其可能作为区分骨肉瘤病人化疗敏感性的生物标志物以及逆转骨肉瘤阿霉素耐药的可能靶点。这些结果为涉及骨肉瘤化疗的lncRNA研究提供了新的视点并为揭示它们的调控网络和机制奠定了坚实的基础。

目录

中英文缩略词表

1.前言

2. 材料和方法

2.1 实验材料

2.1.1 组织

2.1.2 细胞系

2.1.3主要试剂和材料

2.1.4 主要实验仪器和器械仪器名称

2.2 实验方法

2.2.1 细胞培养

2.2.2 LncRNA-mRNA联合芯片检测配对的阿霉素敏感和抵抗的骨肉瘤细胞系MG63和MG63/DXR中差异表达的mRNA和lncRNA

2.2.3 qRT-PCR检测细胞中差异表达的lncRNA

2.2.4 慢病毒转染siRNA于阿霉素抵抗的骨肉瘤的细胞系MG63/DXR和KH-OS/DXR

2.2.5 细胞增殖实验（CCK-8实验）检测下调lncRNA ODRUL表达后MG63/DXR和KH-OS/DXR细胞对于阿霉素的敏感性变化

2.2.6 流式细胞术检测下调lncRNA ODRUL表达后MG63/DXR和KH-OS/DXR细胞周期变化

2.2.7 流式细胞术检测下调lncRNA ODRUL表达后MG63/DXR和KH-OS/DXR细胞凋亡变化

2.2.8 细胞侵袭实验检测下调lncRNA ODRUL表达后MG63/DXR和KH-OS/DXR细胞侵袭能力的变化（Transwell实验）

2.2.9 细胞迁移实验检测下调lncRNA ODRUL表达后MG63/DXR和KH-OS/DXR细胞迁移能力的变化（划痕实验）

2.2.10 Real time PCR（qRT-PCR）检测ABCB1、ABCC3、EGFR和IL-6的mRNA表达水平

2.2.11 Western blotting分析ABCB1、ABCC3、EGFR和IL-6的蛋白表达水平

2.2.12 统计分析

3.结果

3.1 LncRNA ODRUL在骨肉瘤阿霉素耐药细胞系中高表达

3.1.1.众多lncRNA和mRNA在阿霉素抵抗的骨肉瘤细胞MG63/DXR和配对的阿霉素敏感的骨肉瘤细胞MG63中差异表达；

3.1.2. PCR验证随机选择的15个lncRNA的表达差异与芯片结果全部一致，这说明了芯片平台的可靠性；

3.1.3. 只有lncRNA ODRUL在阿霉素敏感和抵抗的骨肉瘤细胞系中表达趋势始终是一致的，即耐药株中表达量明显高于敏感株，在一定程度上说明了其稳定性和广泛性；

3.2. 高表达的LncRNA ODRUL与骨肉瘤病人的化疗敏感性及预后负相关;

3.2.1 早期肺转移组骨肉瘤病人肿瘤组织中lncRNA ODRUL的表达量明显高于早期未肺转移组；

3.2.2 骨肉瘤化疗抵抗肿瘤组织中lncRNA ODRUL的表达明显高于化疗敏感组

3.2.3 高表达lncRNA ODRUL的骨肉瘤病人的生存时间明显低于低表达组；

3.3 通过siRNA下调lncRNA ODRUL的表达可部分逆转阿霉素耐药骨肉瘤细胞系对于阿霉素的抵抗

3.3.1 下调lncRNA ODRUL可部分逆转MG63/DXR 和KH-OS/DXR细胞对于阿霉素抵抗性；

3.3.2 下调lncRNA ODRUL后骨肉瘤阿霉素耐药细胞MG63/DXR 和KH-OS/DXR， G1期细胞比例增加；

3.3.3 下调lncRNA ODRUL后骨肉瘤阿霉素耐药细胞MG63/DXR 和KH-OS/DXR，晚期凋亡细胞比例增加；

3.4 通过siRNA下调lncRNA ODRUL的表达后，阿霉素耐药骨肉瘤细胞系MG63/DXR 和KH-OS/DXR，细胞侵袭和迁移能力减弱

3.4.1下调lncRNA ODRUL后骨肉瘤阿霉素耐药细胞侵袭能力较对照组减弱

3.4.2下调lncRNA ODRUL后骨肉瘤阿霉素耐药细胞MG63/DXR 和KH-OS/DXR，细胞迁移能力较对照组减弱

3.5 LncRNA ODRUL表达下调后多药耐药相关基因ABCB1表达下调

3.5.1生物信息学分析（共表达分析）发现lncRNA ODRUL与ABCB1、EGFR、ABCC3、IL-6等耐药相关基因的表达的相关性均较高；

3.5.2 下调lncRNA ODRUL后，骨肉瘤阿霉素耐药细胞株MG63/DXR 和KH-OS/DXR中在mRNA水平只有ABCB1的表达明显下调，其余基因的表达无明显变化；

3.5.3 下调lncRNA ODRUL后，骨肉瘤阿霉素耐药细胞株MG63/DXR 和KH-OS/DXR中在蛋白水平只有ABCB1的表达明显下调，其余基因的表达无明显变化；

4.讨论

5.全文总结

参考文献

致谢

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