第一部分：R-spondin2促进骨形成的机制研究 目的： R-spondin2是最新发现的W n t信号激动剂R-spondins蛋白家族成员之一。本研究的目的是通过体外细胞研究观察重组人R-spondin2蛋白因子对经典的W n t信号通路活性、矿化结节和成骨细胞标志基因表达的影响。 材料与方法： 成骨前细胞MC3T3-E1诱导成骨培养，不同浓度重组R-spondin2、Dkk-K W nt3a蛋白因子处理细胞。Westem-blot检测Wnt信号通路相关蛋白（活性卩-catenin、磷酸化-Lrp5)表达；ALP染色和活性测定实验检测A L P活性，Real-time P C R和 Westem-blot分别检测成骨细胞标志基因mRNA和蛋白表达；Alizarin Red检测矿化结节形成；荧光素酶报告基因检测W nt信号活性。 结果： 不同浓度重组R-spondin2蛋白因子处理MC3T3-E1细胞，A L P活性明显升髙，并且在100ng/ml浓度时达到平台期，矿化结节的数量和面积明显增加，同时成骨细胞标志基因OPG、Osterix和 Runx2表达明显升髙，但是 RANKL基因表达未受影响，RANKL/OPG比值降低。Western b lo t检测发现R-spondin2处理的细胞中活性P-catenin蛋白表达水平明显升高，细胞免疫荧光提示活性P-catenin蛋白由细胞楽向细胞核内转移。而当加入Dkk-1时，R-spondin2促进活性P-catenin蛋白表达的作用受到抑制，同时成骨相关基因表达、矿化结节形成、A L P活性和W n t信号活性受到抑制；加入W n t3 a时，活性P-catenin蛋白表达进一步增强，同时成骨相关基因表达、矿化结节形成、A L P活性和W n t信号活性进一步明显增强。荧光素酶报告实验提示R-spondin2对W n t信号的活性有积极的影响，同时加入低剂量的Wnt3a，能够显著放大W n t信号活性，然而Dkk-1能够明显消除R-spondin2对W n t信号活化作用。 结论： R-spondin2能够通过活化经典W n t信号通路，促进成骨细胞分化和成熟，诱导骨形成。 第二部分：L G R4在R-spondin2调节骨形成过程中作用研究 目的： 目前研究认为L G R4为 R-spondins的二级受体。本研究的目的是观察L G R4在 R-spondin2诱导骨形成过程中的作用。 材料与方法： 分离和培养原代骨髓间充质干细胞（BMCs)，Real-time PCR检测BMCs和 MC3T3-E1细胞中LGR4，5,6基因表达。不同浓度R-spondin2刺激MC3T3-E1细胞，Westem-blot检测磷酸化-CREB和 A tf4蛋白表达。构建 LGR4 shRNA慢病毒建立稳定的LGR4_/_MC3T3-E1细胞系，100ng/ml重组R-spondin2蛋白因子刺激LGR4_AMC3T3-E1细胞，诱导成骨分化，Alizarin Red染色检测矿化结节形成，A L P染色和A L P活性测定检测A L P活性变化，Real-time P C R和 Westem-blot检测成骨细胞标志基因表达，Westem-blot检测磷酸化-Lrp5、ZNRF3、活性p-catenin蛋白表达’荧光素酶报告基因检测W nt信号活性。 结果： Real-time P C R结果提示B M C s和 MC3T3-E1细胞中L G R4基因表达水平显著高于LGR5、LGR6基因表达水平。Westem-blot分析发现R-spondin2对磷酸化-CREB和Atf4蛋白表达无明显影响。干扰MC3T3-E1细胞的LGR4基因功能，对 LGR5和 LGR6蛋白表达无明显影响，但是R-spondin2失去对矿化结节形成、A L P活性以及成骨细胞标志基因表达的积极诱导作用，同时R-spondin2失去了对W n t信号通路相关蛋白磷酸化-Lrp5和活性P-catenin蛋白表达的促进作用，并且R-spondin2失去对Z N R F3蛋白表达的抑制作用。尽管L G R4基因缺失，R-spondin2仍然能够对矿化结节形成、A L P活性和成骨细胞标志基因的表达存在轻微的促进作用。这些结果提示，R-spondin2可能通过替换受体L G R5和L G R6发挥作用。荧光素酶报告基因进一步证实，R-spondin2对LGR4_aMC3T3-E1细胞中的W n t信号活性无明显影响。 结论： L G R4在 R-spondin2活化W n t信号通路，调节成骨细胞分化和成熟，促进骨形成的过程中扮演关键的受体作用。 第三部分：R-spondin2调节破骨细胞分化成熟的机制研究 目的： 骨形成的过程中需要成骨细胞和破骨细胞共同参与。本研究的目的是观察外源性R-spondin2蛋白因子对破骨细胞分化和成熟的影响。 材料和方法： 建立成骨细胞/破骨细胞共培养体系，100ng/ml R-spondin2蛋白因子加入到共培养体系中，ELISA检测培养液中OPG、RANKL蛋白浓度变化，TRAP染色观察多核细胞，23个核被认为是破骨细胞，显微镜计数，Real-time P C R检测破骨细胞分化标志基因T r a p和破骨细胞融合相关基因Cd47表达变化；同时加入重组RANKL蛋白因子，中和R-spondin2介导分泌的OPG蛋白，TRAP染色观察多核细胞，显微镜计数，Real-time P C R检测Trap和 Cd47基因表达变化。建立LGR4 A MC3T3-E1细胞/破骨细胞共培养体系，100ng/ml R-spondin2蛋白因子加入到共培养体系中，ELISA检测培养液中OPG、RANKL蛋白浓度变化，TRAP染色观察多核细胞，显微镜计数，Real-time PCR检测Trap和 Cd47基因表达变化。破骨细胞单独培养，100ng/ml R-spondin2刺激细胞，TRAP染色观察多核细胞，显微镜下计数，Real-time PCR检测Trap和Cd47基因表达变化。 结果： R-spondin2刺激共培养体系，培养液中O P G蛋白浓度明显升高，而 R A N K L蛋白浓度无明显变化，RANKL/OPG比值降低，破骨细胞标志基因Trap和 Cd47表达降低，破骨细胞分化和成熟受到抑制，破骨细胞数量明显减少；加入RANKL蛋白因子，破骨细胞数量明显增加，Trap和 Cd47表达明显升高，R-spondin2对破骨细胞分化和成熟的抑制作用被中和。当 LGR4_AMC3T3-E1细胞/破骨细胞共培养时，破骨细胞数量明显增加，Trap和 Cd47表达明显升高，R-spondin2对破骨细胞分化和成熟的抑制作用消失。而当破骨细胞单独培养时，R-spcmdin2对破骨细胞分化和成熟无明显影响。 结论： R-spondin2抑制破骨细胞形成需要L G R4基因功能正常表达的成骨细胞存在。 第四部分：R-spondin2对卵巢切除骨质疏松小鼠骨代谢和骨微结构影响的观察研究 目的： 体外实验证实外源性R-spondin2蛋白因子能够促进骨形成。本研究的目的是体内注射外源性R-spondin2蛋白因子，观察卵巢切除骨质疏松小鼠骨代谢和骨微结构的变化。 材料和方法： 72只雌性6周龄C57BL/6J小鼠随机分为卵巢切除组、卵巢切除+R-spondin2组、假手术组、假手术+R-spondin2组，皮下注射重组R-spondin2蛋白因子8周后，E L I S A检测血清O C N、Tracp5b、OPG和 RANKL蛋白浓度，TRAP染色和ALP染色分别检测胫骨近端骨小梁周围破骨细胞和成骨细胞数量及面积变化，盐酸四环素盐标记检测骨矿化沉积率（MAR)和新骨形成率（B F R)，免疫组织化学分析腰椎骨小梁周围成骨细胞中活性P-catenin蛋白表达，microCT分析胫骨近端骨微结构变化。 结果： R-spondin2治疗卵巢切除小鼠8周后，血清O C N、Tracp5b、O P G和 R A N K L水平被逆转，RANKL/OPG比值降低，骨小梁周围破骨细胞数量和面积明显减少，M A R和 B F R明显增加，骨微结构明显改善。尽管骨小梁周围成骨细胞的数量和面积增加趋势并不明显，但是成骨细胞中活性p-catenin蛋白水平明显增加。同时，R-spondin2促使正常小鼠的骨合成代谢增加，胫骨近端破骨细胞数量和面积减少，骨微结构参数BV/TV、Tb.N和Tb.Th明显增加，Tb.Sp明显降低。 结论： 外源性R-spondin2能够促进骨合成代谢，降低骨量丢失，改善卵巢切除小鼠胫骨近端骨微结构。
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