人脐带间充质干细胞来源的微囊通过miR-30抑制线粒体碎裂减轻急性肾脏缺血再灌注损伤的机制研究

摘要

目的：
　　探讨人脐带间充质干细胞（human Wharton-Jelly mesenchymal stromal cells,hWJ-MSC）来源的微囊（extracellular vesicles,EVs）对大鼠肾急性缺血再灌注损伤的治疗作用，并进一步探索线粒体动力学相关的机制研究。
　　方法：
　　从人脐带内分离出脐带间充质干细胞，培养至3-6代后分别用miR-30b/c/d抑制剂处理24小时，更换正常培养基后再无血清处理24小时，收集其条件培养基（conditional medium），运用差速离心法分离提纯微囊，并做蛋白定量。8周龄SD大鼠分为假手术组、损伤组、EV治疗组、EVs+miR抑制剂对照组和EVs+miR-30b/c/d抑制组共8组，并建立单侧肾缺血再灌注损伤（ischemia-reperfusion injury，IRI）模型（右肾切除，左肾缺血45分钟后再灌注）；EV治疗组、miR抑制剂对照组和miR-30b/c/d抑制组再灌注时立即通过尾静脉注射100ugEVs，损伤组注射同样体积的M199细胞培养液。在再灌注24小时后，取肾脏及血液标本进行检测。
　　肾脏组织内细胞总线粒体分裂蛋白(Dynamin-related protein,DRP1)和线粒体DRP1表达情况应用Western-blot进行评估；肾组织内和脐带干细胞来源的微囊内 miR-30b/c/d表达以及 miR抑制剂的效用检测应用qRT-PCR进行评估；微囊在肾组织内的追踪通过免疫荧光进行评估；肾小管上皮凋亡应用caspase-9免疫组化及TUNEL染色法进行评估；肾功能通过检测血清肌酐（Scr）、尿素氮(BUN)浓度进行评估。
　　体外实验，培养SD大鼠肾小管上皮原代细胞，以叠氮化钠NaN3处理肾小管上皮细胞建立体外缺血再灌注损伤模型，损伤后给予 EVs或miR抑制剂处理后的EVs治疗。应用MitoTracker Red CMXRos荧光标记上皮细胞线粒体，通过激光共聚焦显微镜成像评估线粒体动态平衡（mitochondrial dynamics）。
　　结果：
　　体内实验中，在缺血再灌注条件下，肾脏组织内miR-30b/c/d明显降低，细胞总DRP1无明显改变，而线粒体DRP1表达增高，小管上皮细胞凋亡增高，caspase-9表达增多，血清肌酐、尿素氮升高；经EVs治疗后，肾脏组织内miR-30b/c/d表达恢复，线粒体DRP1下降，小管上皮凋亡减轻，caspase-9表达减少，血清肌酐、尿素氮降低，肾损伤减轻；而在miR抑制剂处理过的EVs治疗组中，EVs治疗效果明显下降。
　　体外实验中经过缺氧受损的肾小管上皮细胞内线粒体动态平衡被打破，倾向分裂，EVs治疗后线粒体动态平衡恢复，而miR抑制剂又抑制了这一效应。
　　结论：
　　我们的研究发现了miR-30和DRP1参与了EVs治疗肾脏缺血再灌注损伤的修复机制，EVs能够通过向肾小管上皮细胞传递 miR-30b/c/d来调控 DRP1，恢复线粒体动态平衡，从而发挥抗凋亡作用，减轻肾损伤，保护肾功能。

目录

声明

缩略词

第一章 背景

第二章 方法及材料

2.1材料

2.2实验方法

第三章 实验结果

3.1人脐带间充质干细胞来源的微囊能够减轻肾脏缺血再灌注损伤引起的DRP1激活和线粒体碎裂

3.2人脐带间充质干细胞来源的微囊能够传递miR-30至受损的肾小管上皮细胞

3.3微囊通过传递miR-30b/c/d调节DRP1的表达抑制线粒体分裂

3.4 微囊通过miR-30b/c/d抑制肾组织线粒体凋亡途径

3.5 miR-30b/c/d在微囊治疗保护肾功能中起重要作用

第四章 讨论

第五章 结束语

5.1主要工作与创新点

5.2后续研究工作

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间已发表或录用的论文