mTOR信号通路在门静脉高压性脾肿大发生发展中的调控机制及干预研究

摘要

本文对mTOR信号通路在门静脉高压性脾肿大发生发展中的调控机制及干预进行了研究。本研究分为两个部分：
　　第一部分：mTOR信号通路在肝硬化门静脉高压症患者及动物模型的肿大脾脏中表达情况及其动态关系。
　　目的：探索mTOR信号通路在各种病因所致的门静脉高压性脾肿大中的活化水平，分析mTOR信号通路活化情况与各阶段脾肿大发展的动态关系。
　　方法：收集肝硬化门静脉高压症行脾脏切除术的肿大脾脏标本及正常脾脏标本，分为门静脉高压症组和非门静脉高压症组；采用胆总管结扎离断法和部分门静脉结扎法制备大鼠门静脉高压症模型，分为胆总管结扎组、部分门静脉结扎组及假手术组，并再细分为1、3、7、14、21天时间点小组。通过组织形态学评估人体脾脏的病理改变；计数脾脏指数（脾脏重量/大鼠体重）评估脾脏大小；Western blot法测定mTOR信号通路下游标记物p70S6K、S6、4E-BP1及其磷酸化状态的表达量。
　　结果：人体脾脏标本中，门静脉高压症组脾脏体积显著大于非门静脉高压症组（p<0.01）；两组白髓面积百分比相近，但门静脉高压症组脾脏中的Ki67阳性细胞、α-SMA阳性面积显著大于非门静脉高压症组（p<0.01），且分别集中在脾脏的白髓、红髓区域。Western blot结果发现门静脉高压症组脾脏中P-p70S6K、P-S6的相对表达量显著高于非门静脉高压症组（p<0.05）。动物实验中，脾脏体积随着造模时间进行性增大，同时伴随着P-p70S6K、P-S6相对表达量的逐渐增加，提示mTOR信号通路（mTOR/p70S6K/S6通路）的逐渐活化。
　　结论：增大的白髓体积和广泛的血管新生等增生性病理改变是脾脏体积增大的重要原因之一。大鼠脾脏的进行性增大与mTOR信号通路的逐渐活化之间有一定的正相关性，提示mTOR信号通路（mTOR/p70S6K/S6通路）的逐渐活化可能是驱动脾脏进行增大的动力。
　　第二部分：雷帕霉素阻断mTOR信号通路后对门静脉高压性脾肿大的作用及其机制。
　　目的：探索雷帕霉素阻断mTOR信号通路后对门静脉高压性脾肿大的作用及其机制。
　　方法：采用胆总管结扎离断法和部分门静脉结扎法制备大鼠门静脉高压症模型，从造模第8天起给予雷帕霉素（2mg·kg-1day-1）或同等剂量的5％ DMSO腹腔注射两周。各模型分为雷帕霉素组和安慰剂组。通过血流动力学监测和脾脏指数（脾脏重量/大鼠体重）分别评估门静脉压力和脾脏大小；全自动血液分析仪测定血细胞计数；组织形态学评估脾脏病理改变；Western blot法测定mTOR信号通路的活化水平、血管新生、炎症反应、凋亡等相关标记蛋白的表达量。
　　结果：门静脉高压症组大鼠脾脏白髓面积百分比显著高于假手术组（p<0.05），且富集大量的Ki67阳性细胞。门静脉高压症组大鼠脾脏红髓中发现大量的VEGF、α-SMA及 Ki67阳性组织，且 VEGF及α-SMA蛋白表达量较假手术组显著上调（p<0.05）。Masson染色发现门静脉高压症组脾脏间质中充斥大量的胶原纤维。门静脉高压症组大鼠脾脏中检测到显著升高的炎性指标 IL-1β、 NF-κB及 TNF-α。而经雷帕霉素作用两周后，mTOR信号通路受到了明显抑制，门静脉压力、脾脏指数显著下降，同时伴随着对门静脉高压症大鼠脾脏的白髓淋巴细胞增生、红髓血管新生、间质纤维化及炎症反应的抑制作用。
　　结论：mTOR信号通路异常活化参与调控脾脏白髓淋巴组织增生、红髓的血管新生、间质的纤维化和炎症反应等增生性病理改变，促使脾脏进行性增大；雷帕霉素能够有效缓解门静脉高压症大鼠脾肿大进程。

目录

符号说明表

绪论

1. 门静脉高压性脾肿大发病机制的研究现状

2. mTOR信号通路与门静脉高压症

3. mTOR信号通路与门静脉高压性脾肿大

第一部分 mTOR信号通路在肝硬化门静脉高压症患者及动物模型的肿大脾脏中表达情况及其动态关系

1. 前言

2. 材料与方法

2.1 主要仪器设备

2.2 主要试剂

2.3 人体脾脏标本的采集与检测

2.4 实验动物

2.5 门静脉高压症大鼠模型的制备及分组

2.6 动物标本采集

2.7载玻片的准备

2.8组织包埋与切片制作

2.9 常规苏木精-伊红（HE）染色

2.10 免疫组织化学染色

2.11 组织总蛋白的提取

2.12 蛋白浓度的测定

2.13 蛋白变性，以备western blot实验上样

2.14 Western blot实验检测

2.15 数据处理及分析

3. 结果

3.1 肝硬化门静脉高压症患者肿大脾脏的组织学特点

3.2 肝硬化门静脉高压性脾肿大与mTOR信号通路的活化水平的相关性

3.3门静脉高压性脾肿大的动态发展与mTOR信号通路动态活化

4. 讨论

第二部分 雷帕霉素阻断mTOR信号通路后对门静脉高压性脾肿大的作用及其机制

1. 前言

2. 材料与方法

2.1 主要仪器设备

2.2 主要试剂

2.3 实验动物

2.4 门静脉高压症大鼠模型的制备、分组及用药干预方案

2.5门静脉压力测量与动物标本采集

2.6 载玻片的准备

2.7组织包埋与切片制作

2.8 常规苏木精-伊红（HE）染色

2.9 免疫组织化学染色

2.10 Masson染色

2.11 组织总蛋白的提取

2.12 蛋白浓度的测定

2.13 蛋白变性，以备western blot实验上样

2.14 Western blot实验检测

2.15 数据处理及分析

3. 结果

3.1 雷帕霉素阻断mTOR信号通路的异常活化

3.2 阻断mTOR信号通路后可缓解脾脏肿大，降低门静脉压力

3.3 阻断mTOR信号通路后对血液系统的影响

3.4 阻断mTOR信号通路后可减缓脾脏白髓增生

3.5 阻断mTOR信号通路后可减少红髓血管新生

3.6 阻断mTOR信号通路后可改善脾脏纤维化

3.7 阻断mTOR信号通路后可改善脾脏炎症反应

4. 讨论

全文结论

参考文献

致谢

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