Notch-PI3K/Akt/mTOR信号通路在上皮性卵巢癌发生发展中的作用及其调控机制研究

摘要

研究背景:
　　卵巢癌是一类易于广泛播散和转移的恶性肿瘤,是妇科恶性肿瘤死亡的主要原因[1]。因卵巢癌发病隐匿,同时缺乏有效的筛查手段,致使75％的患者确诊时已属晚期。尽管手术及术后铂类为主的联合化疗极大地提高了患者的生存期,但晚期患者5年生存率始终徘徊在25~35%[2],预后仍然很差,主要因为对卵巢癌的发生发展机制不清楚,导致治疗手段不足。故一直以来,卵巢癌的发病机制研究是妇科肿瘤学界关注的热点。近年来研究表明,卵巢癌的发生和进展可能与Notch信号通路、PI3K/Akt/mTOR信号通路有关,但具体机制尚不清楚,值得进一步探索。
　　Notch信号通路是一个在进化过程中高度保守的信号通路,广泛存在于无脊椎动物和脊椎动物的多个物种之中,它是介导细胞和细胞之间直接接触的主要信号通路之一,调控了多细胞机体的细胞凋亡、增殖和分化。该通路的异常激活或结构性活化与多种组织恶性肿瘤的发病有关。然而,Notch信号通路作用的发挥也必须与其他信号通路相协调完成。研究发现,Notch信号通路的激活经磷脂酰肌醇-3-羟激酶-丝氨酸/苏氨酸激酶(PI3K-Akt)途径发挥促增殖作用。
　　PI3K/Akt/mTOR信号通路在生物体内众多细胞信号通路中占据相当重要的地位,参与调控如增殖、代谢、生长、分化、凋亡等多种生命现象,同时在炎症、肿瘤、代谢和心血管疾病的发病机制中起重要作用,对PI3K-Akt-mTOR通路的研究是目前生命科学研究领域的热点。
　　本课题旨在阐明Notch与PI3K/Akt/mTOR信号通路在卵巢上皮性癌中的发生、进展(或侵袭)中的作用机制及两信号通路之间的相互调控关系,为卵巢癌的发病机制研究提供实验依据,为卵巢癌的治疗提供新的药物作用靶点。
　　目的:
　　1.探讨Notch3及其下游分子Hes-1以及PI3K/Akt/mTOR下游分子pS6和p4E-BP1蛋白在上皮性卵巢癌组织中的表达及其与临床病理学特征及总生存期的关系。通过对Notch3蛋白及PI3K/Akt/mTOR下游分子pS6和p4E-BP1蛋白之间的相关性分析,评价Notch通路和PI3K/Akt/mTOR通路彼此之间是否存在相互调控关系。
　　2.检测卵巢癌OVCAR3细胞系中的Notch3、Hes-1及PI3K/Akt/mTOR下游分子pS6和p4E-BP1mRNA及蛋白的表达。采用Notch信号通路抑制剂DAPT、Jagged-1配体培养液分别作用于卵巢癌OVCAR3细胞后,检测Notch信号通路下游Hes-1基因及蛋白表达,以及PI3K/Akt/mTOR下游pS6和p4E-BP1基因及蛋白的表达,通过正反两方面的实验结果来说明Notch及PI3K/Akt/mTOR信号通路在卵巢癌中的协同作用。
　　3.探讨Notch、PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制剂及其联合应用对卵巢癌OVCAR3细胞增殖、细胞凋亡的作用,探索有效的信号通路抑制剂及其联合应用方案以最大限度的抑制卵巢癌细胞增殖分化,为临床寻找卵巢癌治疗的新靶点提供理论依据。
　　材料和方法:
　　1.研究材料:①临床标本:卵巢上皮性癌标本120例(根据组织学分类分为浆液性囊腺癌60例、粘液性囊腺癌60例,根据手术病理分期分为I、II期41例、III、IV期79例,所有患者术前均未行化疗及免疫治疗),卵巢良性上皮性肿瘤30例,正常卵巢组织30例;②人卵巢癌OVCAR3细胞系。
　　2.卵巢癌组织中Notch信号通路及PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白的检测:采用免疫组织化学法。
　　3.人卵巢癌OVCAR3细胞中Notch信号通路及PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白及基因的检测:采用逆转录聚合酶链(RT-PCR)法及Western-blot法。
　　4.采用Notch信号通路抑制剂DAPT、Jagged-1配体培养液分别作用于卵巢癌OVCAR3细胞后,检测其下游Hes-1基因及蛋白表达,以及PI3K/Akt/mTOR下游pS6和p4E-BP1基因及蛋白的表达。采用逆转录聚合酶链(RT-PCR)法及Western-blot法。
　　5.人卵巢癌OVCAR3细胞Notch信号通路及PI3K/Akt/mTOR信号通路的调控:采用Notch信号通路抑制剂DAPT、mTOR通路抑制剂雷帕霉素、Akt-ERK信号通路抑制剂Ly294002作用于OVCAR3细胞。
　　实验分组:①对照组:卵巢癌OVCAR3细胞中仅加入RPMI-l640培养液;②DAPT组:卵巢癌OVCAR3细胞中加入Notch信号通路抑制剂DAPT,浓度为10μmol/L,作用48h;③Rapamycin组:卵巢癌OVCAR3细胞中加入mTOR通路抑制剂Rapamycin,浓度为100nmol/L,作用48h;④Ly294002组:卵巢癌OVCAR3细胞中加入Akt-ERK信号通路抑制剂Ly294002,浓度为50μmol/L,作用48h;⑤DAPT+Rapamycin组:卵巢癌OVCAR3细胞中加入浓度为10μmol/L DAPT及浓度为100nmol/L Rapamycin,作用48h;⑥DAPT+Ly294002组:卵巢癌OVCAR3细胞中加入浓度为10μmol/L DAPT及浓度为50μmol/L Ly294002,作用48h。
　　6.细胞增殖的检测:采用MTT法。
　　7.细胞凋亡的检测:采用PI染色流式细胞术方法。
　　结果:
　　1.Notch3、Hes-1蛋白、pS6和p4E-BP1蛋白在上皮性卵巢癌组织中的表达:
　　(1)Notch3、Hes-1蛋白在正常卵巢组织、良性卵巢囊腺瘤组织、上皮性卵巢癌组织中均有阳性表达,阳性率分别为16.7%、70%、91.7%和20%、70%、95%,上皮性卵巢癌中Notch3、Hes-1蛋白的表达显著高于正常卵巢组织及良性卵巢囊腺瘤组织(P<0.001,P<0.001),与临床分期、病理分级、组织类型、淋巴转移及腹水有关,与患者年龄无关。
　　(2)Notch3蛋白与Hes-1蛋白在上皮性卵巢癌中的表达呈正相关,rs=0.715, P<0.001。
　　(3)pS6、p4E-BP1蛋白在正常卵巢组织、良性卵巢囊腺瘤组织、上皮性卵巢癌组织中均有阳性表达,阳性率分别为16.7%、76.7%、82.5%和23.3%、73.3%、90%,上皮性卵巢癌中pS6、p4E-BP1蛋白的表达显著高于正常卵巢组织及良性卵巢囊腺瘤组织(P<0.001,P<0.001),与临床分期、病理分级、组织类型、淋巴转移及腹水有关,与患者年龄无关。
　　(4)Notch3蛋白与pS6蛋白在上皮性卵巢癌中的表达呈正相关,rs=0.668, P<0.001。
　　(5) Notch3蛋白与p4E-BP1蛋白在上皮性卵巢癌中的表达呈正相关, rs=0.661,P<0.001。
　　(6) Notch3蛋白的表达与患者的生存期有关,高表达者的危险比例为HR=8.362(95.0%CI2.154~32.461)。
　　(7)Notch3及pS6高表达组总生存期较低,低表达组的总生存期明显较高(χ2=41.479,P<0.001)。
　　(8)Notch3和pS6高表达组腹水阳性率为82.1%,显著高于中间组(51.9%)及低表达组(27%),χ2=28.448,P<0.001。
　　2.Notch3、Hes-1蛋白、pS6和p4E-BP1蛋白在人卵巢癌OVCAR3细胞系中的表达:
　　(1) Notch3、Hes-1蛋白、pS6和p4E-BP1蛋白在人卵巢癌OVCAR3细胞系中呈阳性表达;
　　(2) Notch通路抑制剂DAPT与OVCAR3细胞系共培养,Notch信号通路的下游Hes-1、PI3K/Akt/mTOR下游pS6和p4E-BP1mRNA及蛋白的表达下调。
　　(3)重组Jagged-1蛋白与OVCAR3细胞系共培养, Notch信号通路的下游Hes-1、PI3K/Akt/mTOR下游pS6和p4E-BP1mRNA及蛋白的表达上调。
　　3.Notch信号通路抑制剂DAPT、mTOR通路抑制剂雷帕霉素、Akt-ERK信号通路抑制剂Ly294002对人卵巢癌OVCAR3细胞的影响:
　　(1)DAPT、雷帕霉素、Ly294002单独应用均可显著减少OVCAR3细胞的数量,其中DAPT、雷帕霉素及DAPT、Ly294002联用效果优于单用一种药物;
　　(2)DAPT与Ly294002及DAPT、雷帕霉素联合应用可诱导细胞凋亡增多。
　　结论:
　　1. Notch信号通路与上皮性卵巢癌的发生密切相关。
　　2. PI3K/Akt/mTOR信号通路与上皮性卵巢癌的发生密切相关。
　　3. Notch3在上皮性卵巢癌组织中的高表达与患者的临床分期、病理分级、组织类型、淋巴转移及腹水有关,与患者年龄无关。Notch3蛋白的高表达与患者生存期(不良预后)密切相关。高表达Notch3及pS6患者总生存期缩短。
　　4. Notch信号通路与PI3K/Akt/mTOR信号通路存在相互调控关系。
　　5. DAPT与Ly294002或DAPT与雷帕霉素联合应用可起到诱导细胞凋亡及抑制细胞增殖的作用。

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中英文缩略词表

前言

第一部分Notch及PI3K/Akt/mTOR信号通路与上皮性卵巢癌临床病理学特点及预后的关系

1.1 实验材料与方法

1.2 实验方法

1.3 实验结果

1.4 讨论

第二部分 Notch3及PI3K/Akt/mTOR信号通路在卵巢癌

2.1 实验材料与方法

2.2 实验方法

2.3 实验结果

2.4 讨论

第三部分 联合阻断Notch及PI3K/Akt/mTOR信号通路对卵巢癌细胞增殖和凋亡的影响

3.1 实验材料与方法

3.2 实验结果

3.3 讨论

结论

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果

综述