肿瘤相关成纤维细胞促进上皮性卵巢癌细胞顺铂耐药的机制研究

摘要

目的：卵巢癌的铂类耐药是造成肿瘤复发和死亡率居高不下的重要原因。肿瘤微环境与肿瘤的耐药性密切相关，而肿瘤相关成纤维细胞（Cancer-associated fibroblasts，CAFs）是肿瘤微环境中数量最多的细胞，本课题拟从卵巢癌组织中分离并鉴定CAFs，深入探讨CAFs与上皮性卵巢癌细胞顺铂耐药的关系及其分子机制，为逆转卵巢癌细胞的顺铂耐药提供新的思路。
　　方法：通过组织块爬行法和酶消化法从卵巢癌组织中提取CAFs，利用免疫荧光技术检测CAFs中间质细胞标志物vimentin和CAFs的特异性标志物α-SMA的表达情况；利用Western blot技术检测CAFs中上皮细胞标志物CK-8的表达水平。收集CAFs的培养上清（CAFs-CM），与新鲜培养基以1:1或2:1的比例混合制备共培养的混合培养基（Mix1:1和Mix2:1）；利用CCK-8技术检测在正常培养基（Normal）、Mix1:1和Mix2:1培养条件下上皮性卵巢癌细胞A2780和ES2中顺铂的半数抑制浓度（IC50值）；运用流式细胞技术检测细胞在以上三种培养条件下顺铂诱导的细胞凋亡率；利用Western blot技术检测细胞在以上培养条件下凋亡执行蛋白caspase-3及其剪切体cleaved caspase-3的水平、抗凋亡蛋白Bcl-2和Survivin的表达及二者的上游调控者STAT3的磷酸化(p-STAT3)水平。加入STAT3的抑制剂Cryptotanshinone验证Cryptotanshinone能否逆转CAFs-CM培养条件下的A2780和ES2细胞对顺铂的耐药性、顺铂诱导的凋亡率及抗凋亡蛋白 Bcl-2、Survivin及 p-STAT3的表达。
　　结果：从卵巢癌组织中提取的CAF s高表达间质细胞标志物 vimenti n和CAFs的特异性标志物α-SM A，而上皮细胞标志物 CK-8阴性；CAFs-C M使得A2780和 ES2细胞对顺铂的IC50值逐渐增高（P<0.05），且增高程度与 CAFs-CM的浓度成正比,提示 CAFs-CM促进卵巢癌细胞耐药并呈浓度依赖性；进一步的研究发现 CAFs-CM抑制顺铂诱导的细胞凋亡（P<0.05），细胞在正常培养基（Normal）、混合培养基 Mix1:1和 Mix2:1中的凋亡率分别为：A2780细胞中Normal组20.02±1.69％； Mix1:1组9.19±0.72%； Mix2:1组3.27±0.75%；ES2细胞中 Normal组21.73±1.62%；Mix1:1组13±1.56%；Mix2:1组6.47±0.67%；可以看出CAFs-CM抑制细胞凋亡也呈CAFs-CM浓度依赖性。同时，CAFs-CM抑制凋亡执行蛋白 caspase-3的活化，促进抗凋亡蛋白 Bcl-2、Survivin及p-STAT3的表达（P<0.05）。加入STAT3抑制剂Cryptotanshinone逆转了 CAFs-CM培养下的细胞对顺铂产生的耐药性（P<0.05），同时Cryptotanshinone可以促进顺铂诱导的细胞凋亡（P<0.05），抑制 Bcl-2、Survivin及p-STAT3的表达（P<0.05）。
　　结论：CAFs-CM可以诱导卵巢癌细胞对顺铂产生耐药性，CAFs-CM激活STAT3信号通路，促进下游抗凋亡蛋白 Bcl-2和Survivin的表达，进而抑制顺铂诱导的细胞凋亡。

目录

声明

缩略词表

第一章 研究背景和问题的提出

1.1 卵巢癌铂类药物耐药的研究现状

1 . 2 肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）的研究现状

1.3 CAFs和肿瘤耐药的研究进展

1.4 CAFs与卵巢癌的研究进展及本文的主要研究内容

第二章 肿瘤关成纤维细胞的分离和鉴定

2 .1实验材料和方法

2 .2 结果

2 .3 讨论

第三章 CAFs的培养上清诱导卵巢癌细胞顺铂耐药的研究

3 .1实验材料和方法

3 .2 结果

3 .3 讨论

第四章 C A F s培养上清通过激活STA T3促进卵巢癌细胞顺铂耐药的机制研究

4.1实验材料和方法

4 .2 结果

4 .3 讨论

全文结论

参考文献

致谢

硕士期间发表文章

附录