尼古丁对雄性小鼠生殖能力的影响及其诱发的神经行为学效应跨世代传递的表观遗传学研究

摘要

吸烟是世界上最大也是最受关注的公共卫生问题之一。诸多研究均已经显示，吸烟等不良生活习惯会对男性的生育力产生负面影响，甚至进一步影响下一代的健康。目前，这一现象背后的具体分子机制却还不甚清楚。为了进一步观察吸烟对男性生育力的影响并揭示其内在的分子机制，本实验室前期已经建立了一个模拟人类重度吸烟的小鼠模型。通过该动物模型，我们观察到了吸烟可以直接引发小鼠的精子质量下降并进一步造成其后代的出生率下降。此外，我们前期的工作利用经典的蛋白质组学的分析手段探究吸烟对小鼠睾丸、附睾及成熟精子中蛋白质表达谱的影响，从而揭示了吸烟影响男性生殖能力的部分内在分子机制。鉴于烟草中有害物质的多样性，本研究单独研究烟草中的主要毒性物质尼古丁对男性生殖系统的毒理作用，同时我们也观察了尼古丁通过改变影响精子中的表观遗传学修饰进而对后代的健康造成的影响。
　　首先，我们构建了一个尼古丁处理小鼠模型以模拟重度吸烟人群每日接触的剂量。将6周龄的雄性C57BL/6J小鼠随机分为尼古丁处理组和对照组。尼古丁处理组以0.2 mg/100 g/日的剂量接受尼古丁腹腔注射，每天注射4次（白天每隔4小时一次），每次0.05 mg/100 g的尼古丁处理以避免小鼠出现抽搐等不适现象。对照组(F0-con)则以等量的生理盐水处理，持续处理5周。
　　随后，通过总蛋白双向凝胶电泳与质谱鉴定联用的方法，鉴定出了尼古丁处理小鼠睾丸及附睾组织中的蛋白质表达谱差异。在睾丸组织中，尼古丁处理造成19种蛋白在处理组及对照组小鼠之间显著差异表达，而其中的17种被成功的鉴定出来。后续的生物信息学分析如GO分析及IPA通路分析，提示了这些被鉴定的差异表达蛋白大部分都与细胞的运动性有关，因为其主要集中于与细胞骨架调节信号通路和细胞能量代谢调节过程中。为了进一步研究尼古丁暴露对小鼠精子运动能力的真实影响，我们利用计算机辅助精子分析（CASA）技术观察了小鼠精子的运动性指标。结果显示，多种精子运动性指标都在尼古丁处理小鼠精子中出现了显著上调。这显示了尼古丁暴露显著提升了小鼠精子的运动性能，同时可能抑制了其能量代谢过程。此外我们还观察到一种细胞骨架调节蛋白PFN1在尼古丁处理小鼠生精细胞中发生高表达，而其高表达是由于其编码基因Pfn1启动子区域的低甲基化造成的。表达上调的PFN1通过提升生精细胞中肌动蛋白的周转效率从而最终造成小鼠成熟精子运动能力的提升。尼古丁促进小鼠精子的运动性并抑制其能量代谢过程，这一现象可能最终影响精子的受精过程，并对后代的生长发育产生一定的影响。
　　在附睾组织中，蛋白组学分析鉴定出了15种在尼古丁处理和对照组之间差异表达的蛋白。随后的生物信息学分析显示这些差异表达蛋白主要集中于与分子转运过程及多元醇途径中。这显示了尼古丁可能削弱了附睾的分泌功能并最终影响精子的成熟进程。通过免疫荧光技术发现，尼古丁暴露可以显著降低小鼠附睾管腔中的附睾小体分布，这一现象从另外一个角度印证了尼古丁对附睾分泌功能的损伤。此外，我们通过观察小鼠精子体外获能后蛋白酪氨酸磷酸化的水平发现，尼古丁处理组小鼠精子的体外获能过程受到干扰，并且其精液中果糖浓度也显著较低。我们的研究发现产生果糖的多元醇通路中重要的组分山梨醇脱氢酶的编码基因Sord是一个受启动子DNA甲基化水平调控的基因。在小鼠附睾尾部组织中，尼古丁造成Sord基因启动子特定区域DNA高甲基化，并降低SORD的表达水平，最终造成小鼠精子成熟过程中重要的能量物质果糖的缺乏从而影响精子的体外获能过程。附睾分子转运功能下降和SORD的低表达可能是尼古丁对附睾组织毒理学作用的分子基础。
　　理论上，尼古丁在小鼠生精过程中造成的DNA甲基化水平的改变可以通过受精作用传递到下一代，并影响其胚胎的发育过程并造成一定的表型。为了观察尼古丁引发的神经精神病学效应通过父系表观遗传学信息实现跨世代传递的现象，我们采用了多种动物行为学的实验手段观察了吸烟和尼古丁处理雄性小鼠（F0）及其雄性后代（F1）的神经精神状态。动物行为学数据显示，吸烟及尼古丁处理雄性小鼠可以自身产生类似抑郁症的行为学表型，却使其雄性后代（F1）的自发活动性显著增加，抑郁程度降低。但是这种父系尼古丁处理引发的动物行为学表型并没有通过表观遗传学信息随着父系链传递到F2代小鼠。随后通过二代测序，我们观察了尼古丁处理小鼠精子中转录谱学层面的变化并以此提示我们产生获得性表型跨世代传递的可能机制。结果显示在尼古丁处理小鼠的精子中与Wnt4通路相关的关键基因的表达都发生了明显变化，这提示了尼古丁可能通过影响父系Wnt4信号通路，进而影响到子代的精神状态。我们后续的分子生物学研究还显示，父系尼古丁处理可引发 F1代小鼠脑组织海马区中Wnt4通路的活化，从而促进下游的关键蛋白分子GSK-3从非磷酸化向磷酸化状态转变。非磷酸化的GSK-3分子具有神经毒性，而尼古丁处理缓解了这种毒性作用，从而改变了F1代小鼠的行为学表型。究其原因，我们发现调控 Wnt4表达水平的一种 miRNA，mmu-miR-15b在尼古丁处理的F0代小鼠睾丸、精子及其F1代小鼠脑组织中均低表达，这可能是导致 Wnt4通路激活的原因。对mmu-miR-15b基因的生物信息学分析发现，其表达可能受到启动子区域之前的CpG岛滩（CpG shore）的DNA甲基化水平调控。因而，利用表观遗传学的研究手段，现有实验结果提示尼古丁处理导致小鼠精子中mmu-miR-15b基因CpG岛滩区域高甲基化，从而下调其表达水平。而这一表观遗传学信息介导了尼古丁引发的神经精神病学效应的父系跨世代传递。当将过表达WNT4或mmu-miR-15b的慢病毒质粒在小鼠特定脑区中注射后的动物行为学表型实验，均证明了 Wnt4的上调确实可以诱发小鼠活动性增加，抑郁程度减轻。而在父系尼古丁处理的F1代小鼠丘脑中过表达mmu-miR-15b则能逆转其行为学表型，这显示了尼古丁引发的动物行为学表型处理确实是通过mmu-miR-15b实现了父系跨世代的遗传。
　　综上所述，尼古丁处理可以引发小鼠精子发生过程中一系列的表观遗传学现象。睾丸组织中，尼古丁造成Pfn1基因启动子区域低甲基化，从而上调生精细胞中细胞骨架蛋白周转，最终造成小鼠精子运动能力上升。而在附睾组织中，尼古丁则造成Sord基因启动子区域高甲基化，从而抑制多元醇通路并导致精液中果糖浓度较低，最终影响成熟精子的体外获能过程。在成熟精子中，尼古丁引发小鼠精子中mmu-miR-15b基因CpG岛滩区域高甲基化，从而下调其表达水平。而这一表观遗传学信息通过受精作用传递到下一代并保留到脑组织中，进一步促使后代小鼠脑组织中Wnt4通路激活从而产生高自发活动的行为学表型。

目录

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缩略词表

第一章 绪论

1.1 吸烟对男性生育能力的影响

1.2 烟草中的主要有害物质

1.3 吸烟影响男性生育能力的分子机制

1.4 吸烟引发的表观遗传学效应

第二章 尼古丁对小鼠睾丸组织中蛋白表达谱的影响

2.1 背景介绍

2.2 实验仪器及材料

2.3 实验方法

2.4 实验结果

2.5 讨论

第三章 尼古丁对小鼠附睾组织中蛋白质表达谱的影响

3.1 背景介绍

3.2 实验仪器及材料

3.3 实验方法

3.4 实验结果

3.5 讨论

第四章 父系尼古丁处理对雄性后代小鼠行为的影响

4.1 背景介绍

4.2 实验仪器及材料

4.3 实验方法

4.4 实验结果

4.5 讨论

第五章 全文总结

参考文献

附录：主要实验试剂的配制方法

致谢

攻读博士学位期间已发表或录用的论文