哈茨木霉菌PAF-AH-like和hyd1基因系统诱导玉米抗弯孢叶斑病机理研究

摘要

玉米弯孢叶斑病是我国玉米产区的主要病害之一，通过生物防治技术系统诱导玉米免疫反应，抵抗叶斑病菌侵染，是实现玉米病害绿色防控的重要途径。木霉菌分布广泛，已普遍用于植物病害的生物防治，但关于木霉菌处理种子或根系系统诱导寄主对地上部病害的抗性分子机理国内外未见报道，尤其关于木霉菌产生的MAMPs(microbial-associated molecular patterns)分子及其与玉米根系受体互作分子模式尚属空白。本研究首先成功克隆来自哈茨木霉菌（Trichoderma harzianum）磷脂酶 A2超家族成员类血小板激活因子乙酰水解酶基因（Platelet-activating factor acetylhydrolase like gene，PAF-AH-like gene），原核表达分析明确了PAF-AH酶活性，其最适pH为6，并且活性不依赖Ca2+。该基因定位于木霉菌细胞质，与木霉菌拮抗立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）及根系特异互作有关。同时证明了 PAF-AH-like通过调控玉米叶片茉莉酸/乙烯通路相关基因的表达诱导了玉米抗弯孢叶斑病的作用。
　　为证实木霉菌系统诱导玉米抗叶斑病的MAMPs模式，本研究从哈茨木霉菌克隆获得一个II类疏水蛋白hyd1基因，发现其定位在木霉菌的细胞膜上，具有分泌到胞外的功能、并促进了木霉菌对玉米根系定殖，同时证明了该蛋白能在根系细胞膜上表达，说明hyd1与调控木霉菌定殖玉米根系有密切关系，为Hyd1作为MAMPs分子与玉米根系互作诱导玉米对叶斑病的抗性提供前提条件。hyd1基因不同的转化子处理玉米自交系B73种子，四叶期离体和活体叶片挑战接种弯孢叶斑病菌(Curvularia lunata)，结果表明：hyd1敲除突变株KO16处理植株叶片的病斑明显比野生型处理的病斑面积大，过表达转化子OE3和OE5病斑面积最小，且差异显著，证明了hyd1具有系统诱导抗性的作用。为了从玉米根系筛选响应或识别木霉菌Hyd1的互作蛋白，通过酵母双杂交的方法筛选到与Hyd1互作的玉米根系Ubiquilin1-like蛋白，并采用BiFC和pull down方法证明了两者发生了直接互作。在酵母菌内确定了Ubiquilin1-like与Hyd1互作的区域，Hyd1的信号肽序列是其与Ubiquilin1-like-N互作所必需的，并发现Hyd1中8个半胱氨酸也参与了上述互作过程。为了进一步证明hyd1和ubiquilin1-like基因是否存在协同增加植物抗病性的作用，通过转基因方法，明确了hyd1与ubiquilin1-like在拟南芥中共表达后能明显促进拟南芥对灰霉病的抗性，转基因植株叶片病斑面积仅为野生型的50%。而且通过烟草细胞系证明了Hyd1与Ubiquilin1-like蛋白定位在细胞膜上，并且Hyd1能提高Ubiquilin1-like蛋白的稳定性。通过RNA-seq全局分析了叶片挑战接种24 h后木霉菌hyd1调控寄主防御反应的变化，结果表明，主要通过油菜素内酯（brassinosteroids，BR）通路进行信号传导产生抗病性，此通路很多基因差异表达接近3倍。初步用BANK1-4突变体验证表明，hyd1很可能是通过BAK1进行信号转导产生抗病性。同时hyd1也与JA/ET信号通路相关联，钙调蛋白（CaM）及WRKY的一些基因也发生了变化。根据上述研究，推测哈茨木霉菌系统诱导玉米抗弯孢叶斑病的MAMPs模式：哈茨木霉菌在玉米根系分泌的Hyd1与根系类受体蛋白Ubiquilin1-like互作，而Ubiquilin1-like可能与油菜素内酯受体BAK1互作一起形成复合物导致BR信号的转导，同时也激发了JA/ET、钙调蛋白（CaM）及WRKY基因的表达从而产生相关的抗病反应。这为进一步揭示木霉菌疏水蛋白MAMPs分子与植物内类PRRs(pattern recognition receptors，PRRs)蛋白互作的分子机理提供重要线索。

目录

声明

本文主要缩略词英文及中文对照

第一章 文献综述

1.1木霉菌生物防治机理概述

1.2植物非寄主抗性与基础免疫

1.3植物免疫反应中的效应因子

1.4动物免疫反应因子-磷脂酶代谢

1.5免疫反应中的信号系统

1.6玉米病害与系统诱导抗性

1.7 科学问题的提出

1.8研究意义及主要内容

第二章 木霉菌PAF-AH-like基因的克隆及生防功能分析

2.1材料

2.2 方法

2.3 结果与分析

2.4 小结与讨论

第三章 木霉菌hyd1基因克隆及功能研究

3.1 材料

3.2 方法

3.3 结果与分析

3.4 小结与讨论

第四章 木霉菌Hyd1蛋白在玉米根系中互作蛋白的筛选及其互作机理的研究

4.1 材料

4.2方法

4.3 结果与分析

4.4 小结与讨论

第五章 木霉菌hyd1诱导玉米抗弯孢叶斑病菌侵染网络的研究

5.1 材料

5.2方法

5.3 结果与分析

5.4 小结与讨论

第六章 全文的创新点、总结及展望

1. 本论文创新点

2. 全文总结

3. 后期研究与展望

参考文献

附录

致谢

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